微生物可行性报告完整版

重组HSV-Ⅱ型溶瘤病可行性报告学院：生物工程学院专业班级：1501学生姓名： 吕永斌 指导教师：裘娟萍摘要争论，目前已经能建立以VeroHSV一Ⅱ病反响器微载6.62lgTCID50／mlVero方法，可打算用于工业化生产。关键词：HSV-Ⅱ；Vero正文：产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病 ,承受Vero细胞培育技术生产的重组溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)具有良好的溶源性、靶向性和安全性,具有重要的应用价值国内人类肿瘤疫苗的有关争论处于刚起步状态，面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有格外重要的社会和经济价值。经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效型病有望用于肿瘤的临床争论。1.溶瘤病毒的作用机制生产材料：①细胞培育：Vero②病毒株：重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒，中国医学科学院肿瘤争论所供给。③微载体：Cytodex1④生物反响器23Cytodex14.Vero5.生物反响器经济效益：经查阅，o细胞为免费〔不包邮请供给〔几乎免费；微载体x1市价为3瓶；生物反响器可租借。本钱保守估量〔不算设备使用费：每支本钱约为6元，预售价为8人工生产费，约可净得利润支。生产工艺流程：6.生产车间流程图在反响罐培育间中进展重组HSV—Ⅱ病的微载体悬浮培育，步骤如下：①Cytodex1Cytodexl置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶／瓶PBS(pH7．280～150mL／gCytodex13hPBS3hPBS压灭菌121℃，30min，冷却后倾去PBS，用培育基洗涤一次后倾去，重参与颖4℃冰箱平衡过夜，待用。PBS3h(可过夜)，倾去并用PBS121℃，30minPBS，用培育基洗涤一4~C②VeroCytodex13g／L2O～30cells／(DOAir，ON：的进气比40％空气饱和度，pHCO7．5％(w／v)NaHCO把握③oo细胞于转瓶／反响器内微载体上培育2～4d，待长成单层时，向培育基中参与确定体积的微载体，与长满细胞的老微载体依据确定比例混合，进展间歇／连续搅拌培育，待细胞转移贴附成功后，进展常规连续搅拌培育。④Vero细胞的微载体在位消化转移培育：Vero细胞于转瓶／反响器内微载体上培育2～4d，待细胞长成单层，即处于指数生长期时，进展在位消化转移培育。首先停37~CPBS150mlPBS／gMC37~C(0．02W／V)EDTA50ml／gMC2min定的比例参与含微载体的培育基，并以确定转速快速搅拌约2min后，补足培育35～40r／min12h上完全贴附后，将微载体悬液放大到下一级生物反响器内进展培育。⑤重组HSV-Ⅱ病毒的反响器培育：Vero2～4d，待细胞生长至80％～90％集合时，接种病毒。接毒时将反响器内培育基排出并用PBS2次，参与含BSA(VD．LSM)，同时将培育温度由37~C降为32％进展病毒培育。待细胞病变至80％～90％后，将培育液进展4~C盐裂Reed—MunchTCID50。⑥待细胞病变后收获病毒。高效构建技术路线：利用病毒活性增效剂〔关心因子〕与重组HSV—Ⅱ病共同左M1,M2,M3,M4，设计试验选出能够有效增加该溶瘤病毒的增效剂。设置5个一样的培育基〔适宜的PH，温度和渗透压〕放入等量肿瘤细胞作为唯一养分物质，1-4号分别参与一样剂量的M1,M2,M3,M4增效剂，5号参与等量生理盐水作为比照。放在适宜的环境下培育确定时间后分别对5个培育基中的肿瘤活细胞进展计数，统计并肿瘤活细胞最少的那一组，可以初到溶瘤病中，确认其安全性后投入到临床应用。产品的质量标准：规格：本品为注射剂，1ml/支.11ml，病毒滴度>=6.00lgTCID50／ml;重金属：含重金属不得超过百万分之十;接种部位：手臂三角肌肌肉。无菌检査：依法检査〔1101)，应符合规定;GMP标准:在工作场所，保护工人远离生物制剂暴露的风险；〔微生物体或生物体含有重组DNA分子；保证人或兽用生物制品和药品的安全性，vero细胞来源的安全性等。参考文献：MontagnonB，FangetB，NicolasA．Thelarge—scalecultivationofVEROcellsinmicro-carriercultureforvirusvaccineproduction．Preliminaryresultsforkilledpoliovirusvaccine．Developmentsinbiologicalstandardization，1981．47：55．tPMundtrtocellme：movingtowardscellculture—basedviralvaccines．Expertreviewofvaccines，2023，8(5)：607-618．yP．svaccinenyreview，2023，21(1)：198-208．TauberE，KollaritschH，KorinekM，eta1．SafetyandimmunogenicityofaVero—cell—derived，inactivatedJapaneseencephalitisvaccine：anon-inferiority，phaseIII，randomisedcontrolledtria1．TheLancet，2023，370(9602)：1847—1853．HowardMK，KistnerO，BarrettPN．Pre-clinicaldevelopmentofcellculture(Vero一d1cvaccine：569-577．AhmedinJemal，FreddieBray，MelissaMCenter，eta1．Globalcancerprevention．LifeSciencesandMedicine，2023，31(1)：100—110．AudreyLR，DanielleJ，JuliaT，eta1．ScalableproductionofinfluenzavirusinHEK-293cellsforefficientvaccinemanufacturing．Vaccine，2023，28(21)：3661—3671．AllenChen，SwanLP，ChristianD，eta1．Serum—freemicroearrierbasedproductionofreplicationdeficientInfluenzavaccinecandidateviruslackingNS1usingMarangaL，BraziloTF，CarrondoMJ．Virus—likeparticleproductionatlowmultiplicitiesofinfectionwiththebaeulovirusinsectcellsystem．BiotechnolBioeng，2023，84(2)：245-53．veterinaryrabiesvaccineinBHK-21cellsgrownonmicrocarriersina20—1influenzavaccineproduction．Vaccine，2011，29：3320-3328．施桂兰，庄秀芬，韩香萍，等．型溶瘤病毒oHSV2hGM．CSF的构建及其抗肿瘤作用．中华肿瘤杂志，2023，34(2)：89-95．ShiGL，ZhuangXF，HanXP，etal，ConstructionofanewoncolyticvirusoHSV2hGM—CSFanditsanti-tumoreffects．Chineseiourualofoncology，2023，34(2)：89-95．processformicrocarriercultueofMDCKcellsusinglowserummedium．ChinaBiotechnology，2023，32(009)：55-60．LehtinenM．HSVinfectedRAJI-cellsspecifyHSVspecificimmediateearlydryg．s—．o细胞的微载体培育——放大过程中的接种工艺1998，24(006)：6