小麦热激蛋白70家族克隆及表达分析

小麦热激蛋白70家族克隆及表达分析

热激蛋白（hsd）是一个能够响应和改善外部环境的受体蛋白，可以有效地提高生物在恶劣环境中的适应性。首次克隆的热激蛋白是从热激果蝇幼虫唾液腺中分离获得(Tissereetal.,1974)。根据分子量的不同,可将热激蛋白分为6个家族,即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子sHSP和泛素(Carperetal.,1987)。研究发现属于分子伴侣类型的蛋白家族能够在环境胁迫时防止未折叠蛋白变性和促进变性蛋白溶解复性(Sheffieldetal.,1990)。因此,作为分子伴侣家族组成部分的热激蛋白等在生物体抗逆代谢反应中发挥关键作用。在对热激蛋白家族成员研究中,HSP70家族目前最受关注。在真核生物体内,编码HSP70蛋白的基因家族高度保守(GuptaandGolding,1993;Boorsteinetal.,1994),这类蛋白主要参与细胞内多种蛋白质合成后加工和构象改变过程。研究发现,在动物体内,HSP70家族参与多种调控过程,如细胞凋亡、免疫防护反应、参与肿瘤形成及转移和变形蛋白修复等(杨秉芬等,2009;Vegaetal.,2008)。HSP70在植物不同发育阶断基因表达调控和多种代谢过程也发挥重要作用,其表达水平受外界环境条件影响,如受高温胁迫后成熟小麦种子与未经胁迫处理的对照相比,HSP70表达量增加35%~140%(赵强,1998,麦类作物学报,18(6):32-36);而拟南芥幼苗在生长温度发生急剧变化条件下(从12℃上升到27℃),HSP70家族基因的表达水平迅速增加,这说明编码HSP70基因表达水平极易受温度变化影响(KumarandWigge,2010);Cho和Hong(2006)发现超量表达NtHSP70-1能提高转基因烟草植株抗旱能力,由此可以说明HSP70家族蛋白参与植物抗逆调控过程。研究发现,HSP70蛋白不但在植物抗逆过程中发挥重要作用,在植物抗病方面也具有重要影响。Kanzakl等(2003)利用基因沉默技术发现NbHsp70c-1参与了对假单胞杆菌侵染时烟草叶片过敏性坏死斑产生过程。截至目前为止,已从玉米(Rochesteretal.,1986)、拟南芥(Sungetal.,2001a)、小麦(Duanetal.,2011)、番茄、紫茎泽兰(肖艳萍等,2010)、绿豆、菠菜(GuyandLi,1998)等植物克隆到HSP70基因,如从拟南芥中分离得到14个HSP70基因,细胞质蛋白5个、内质网蛋白3个、2个质体间质蛋白和2个线粒体蛋白(Sungetal.,2001a),从菠菜基因组分离到12热激蛋白HSP70基因(GuyandLi,1998),但仅报道了1个普通小麦HSP70蛋白基因,综合拟南芥和菠菜中分离到的HSP70蛋白数量分析,发现小麦基因组中的HSP70蛋白基因还有待于进一步挖掘。病菌侵染和环境胁迫因素是影响小麦产量的关键因子,培育抗性品种是提高小麦产量的切实可行途径之一。小麦基因组中抗性相关基因研究将对培育小麦抗病品种具有一定理论参考价值,HSP70蛋白是小麦抗性调控网络中不可缺少的一员。因此,本研究利用同源克隆方法,期望从Taichung29*6/Yr5文库中分离获得编码HSP70蛋白的全长cDNA序列,并将对获得基因在病原菌侵染和非生物因子胁迫条件下的表达特征进行初步研究。1结果与分析1.1不同功能的植物热激蛋白聚类分析利用小麦cDNA文库筛选获得一个全长为2412bp的HSP70基因cDNA序列。序列分析发现,cDNA序列的开放阅读框从38bp至2110bp,共2073bp,推测其编码691个氨基酸残基的蛋白质,预测所编码的蛋白分子量为7.35kD,等电点为4.75,是酸性蛋白。与植物其它热激蛋白HSP70氨基酸序列比较分析发现,TaHSP70含有HSP70家族蛋白特有的2个主要结构域(即N端ATPase区和C端多肽结合区)和3个次结构域(即N端信号肽,连接N端ATPase区与C端多肽结合区的绞合链部分和C端次结构域)(图1)。氨基酸序列分析发现,N端氨基酸残基54至430的ATPase区约45kD,其氨基酸序列高度保守,具有结合和水解ATP的活性(Flahertyetal.,1990);氨基酸残基441至620为C端多肽结合区,约25kD(Zhuetal.,1996),通过绞合链部分(氨基酸残基431至440)与N端ATPase区连接,这两个功能区在组合成三维构象时可形成深沟,ATP结合位点就位于此深沟基部(Sungetal.,2001b)。N端第1至53氨基酸是TaHSP70信号肽部分,可以引导该基因编码的蛋白定位到相应细胞器中,而TaHSP70C端氨基酸残基621至691组成的功能可变区的氨基酸序列变化较大,三维结构形成的α-螺旋可在ATP结合和水解过程中作为“盖子”使用,在HSP70行使分子伴侣功能过程中发挥重要作用(Zhuetal.,1996)。将TaHSP70与单子叶植物小麦、水稻、玉米、大麦、高粱以及双子叶植物拟南芥、烟草(普通烟和本生烟)、蓖麻、苜蓿(紫花苜蓿和蒺藜苜蓿)、大豆、菠菜、紫茎泽兰、豌豆、牵牛花、黄瓜、番茄、陆地棉、珍珠栗、葡萄和藻类植物衣藻、莱茵衣藻中已克隆的热激蛋白HSP70进行聚类分析,并对该蛋白家族进行初步分类。聚类分析结果发现,可将植物热激蛋白HSP70家族成员分为4个亚家族,即质体间质亚族(PlastidStroma)、线粒体亚族(MitochondrialMatrix)、内质网亚族(EndoplasmicReticulum)和细胞质亚族(Cytosol)(图2)。TaHSP70属于质体间质亚族,与小麦TaHSC70亲缘关系最近,相似性为99.5%。分析聚类图谱右侧网格标注蛋白功能发现,质体间质亚族蛋白参与了植物高温、低温调控途径,同时还与植物发育和抗逆过程相关。由此可推测,热激蛋白TaHSP70可能在小麦抗性过程中发挥重要作用。1.3不同胁迫处理对tahsp70表达的影响大量研究发现,HSP70家族蛋白在植物的不同生理状态和生长环境中发挥重要作用,尤其在植物抵御外界高温胁迫的调控网络中,HSP70具有关键作用。为了明确小麦HSP70家族蛋白基因TaHSP70在抗逆境过程中具体作用,采用半定量RT-PCR方法,分析了TaHSP70在高温、低温、干旱、植物激素ABA、MeJA处理和非亲和条锈菌小种CYR32、白粉菌混合菌种侵染出苗7d后的小麦幼苗中表达情况。结果显示,高温胁迫12h时,TaHSP70的表达水平最高,几乎与未处理(0)相同,此后36h内该基因的表达一直保持在较高水平(图3A),该结果与前人研究结果相同,即HSP70家族基因被高温诱导表达。小麦条锈菌和白粉菌的侵染也能诱导TaHSP70表达,在未接种CYR32时(0),没有检测到TaHSP70的表达,在接种4h时可测到TaHSP70的微弱表达,而在8h时达到最高值,并在48h内一直保持较高水平的表达量(图3B);而当小麦幼苗受到白粉菌侵染24h时TaHSP70的表达量从“无”到“有”急剧升高,并达到最高表达水平,在24h内保持不变(图3C)。同时我们还发现,部分胁迫处理抑制TaHSP70表达,如低温(4℃)胁迫处理过程后,TaHSP70的转录水平明显低于对照(0),随着处理时间的延长,TaHSP70的表达量逐渐下降(图3D)。在植物激素ABA处理后,TaHSP70表达出现下降,但在处理3h后TaHSP70的表达量出现1个高峰值(图3D)。此外,干旱处理对TaHSP70表达也具有抑制作用(图3E)。经过植物激素MeJA处理,TaHSP70表达量略有降低,处理12h后,TaHSP70的表达量最低,但24h又恢复到3h水平(图3D),所以MeJA对TaHSP70表达的影响不明显。因此,TaHSP70表达受到低温、干旱和ABA胁迫抑制,但能被高温处理、条锈菌和白粉菌侵染所诱导。2热激蛋白家族基因对小麦抗病反应的调控热激蛋白是在植物适应外界环境变化过程中发挥重要作用的一类分子伴侣蛋白,共包括6个家族,其中HSP70蛋白家族的研究最为广泛。目前已在拟南芥基因组中发现12个全长HSP70基因,菠菜基因组中12个,2个小麦HSP70基因被克隆,同时在其它多种高等植物和藻类中也发现了HSP70基因。HSP70蛋白家族的氨基酸序列及其功能结构域异常保守,如本研究中的TaHSP70结构分析所示,HSP70蛋白均含有ATP酶区和多肽结合区2个主要结构域和N端信号肽、绞合链和C端多变区3个次结构域,来源于不同物种的HSP70蛋白之间具有较高的相似性。Boorstein等(1994)根据HSP70蛋白锚定于不同亚细胞器而把这类蛋白分为4个亚族,即质体间质亚族、线粒体亚族、内质网亚族和细胞质亚族。本研究根据聚类分析结果,把来自22种高等植物和2种藻类的62个HSP70蛋白分为4亚族,类似于Boorstein等(1994)分类结果。根据对功能已知的热激蛋白HSP70在4个亚族中的分布情况分析,发现质体间质亚族蛋白不但具有抗高温、低温等抗逆功能,同时还参与调控植物对病菌的防卫反应和植物生长发育过程,如高温和低温均能诱导菠菜HSC70-9的表达(Lietal.,1999);拟南芥cpHsc70-1和cpHsc70-2均能正调控拟南芥生长发育过程(Sungetal.,2001a);Duan等(2011)研究发现,属于质体间质亚族的小麦TaHSC70不但被高温诱导表达,亲和条锈菌小种CYR31和非亲和条锈菌小种CYR23也能诱导其表达,说明TaHSC70参与小麦的抗逆和防卫反应过程。本研究的TaHSP70属于质体间质亚族,与HaHSC70相似性最高。半定量RT-PCR分析发现,TaHSP70表达受条锈菌和白粉菌侵染诱导,其表达水平均有不同程度提高,说明该基因也可能参与了小麦的抗病反应过程。在高温胁迫下,TaHSP70的表达量升高,但是升高幅度较小,这与小麦TaHSC70(Duanetal.,2011)的研究结果相似,进一步证实了热激蛋白家族基因能被高温诱导表达。MeJA处理对TaHSP70的表达影响不明显(仅在处理3h时表达量略微升高),但其表达模式与小麦TaHSC70相似。植物激素ABA对TaHSP70和TaHSC70的表达影响不同,在本研究中ABA抑制TaHSP70的表达,但对TaHSC70的在处理初期诱导作用较小(Duanetal.,2011)。在低温胁迫时,TaHSP70具有不同于菠菜HSC70-9的表达模式,即低温抑制TaHSP70的表达而诱导HSC70-9表达。在干旱胁迫时,TaHSP70的表达受到抑制,其表达谱与细胞质亚族NtHSP70-1的研究结果相反(ChoandHong,2006)。结合ABA对TaHSP70表达的抑制作用,我们推测TaHSP70可能通过ABA途径调控小麦对干旱和低温的敏感性。对线粒体亚族和内质网亚族HSP70蛋白分析发现,这两个亚族蛋白参与植物抗逆和发育调控,未见有关这两个亚族成员参与抗病反应调控的报道,如线粒体亚族的拟南芥mtHsc70-1被低温诱导表达,但在种子成熟过程中其表达被抑制(Sungetal.,2001a);内质网亚族蛋白菠菜HSC70-2在高温、低温和伤害处理时表达水平显著提高(Lietal.,1999)。HSP70蛋白4个亚族中细胞质亚族HSP70蛋白的功能最为广泛,包括参与高温、低温、高盐、伤害和干旱胁迫反应,也调控植物发育和抗病防卫反应过程,如大豆CAA44620(RobertsandKey,1991)、普通烟草HSP70(SuriandDhindsa,2008)参与高温诱导调控过程;衣藻CiHsp70在低温和盐(NaCl)胁迫时表达量均不同程度升高(Liuetal.,2010);菠菜HSC70-1对伤害处理有一定调控作用(Lietal.,1999);普通烟草NtHSP70-1的超量表达增加了烟草的抗旱能力(ChoandHong,2006);而沉默NbHsp70c-1能使转基因烟草株系在假单胞杆菌侵染过程中不能形成坏死斑(Kanzakletal.,2003);拟南芥Hsc70-1、Hsc70-2和Hsc70-3均对拟南芥生长发育具有负调控作用,还参与高温和低温胁迫处理植物抗逆过程(Sungetal.,2001a)。Guy和Li(1998)认为细胞质亚族蛋白是最原始的HSP70蛋白,随着时间推移,逐渐演化形成其它3个亚族。所以,植物不同亚族热激蛋白HSP70的功能具有多样性,而且属于同一亚族中或同一基因参与多种调控过程。通过聚类和表达谱分析可以表明,小麦HSP70基因TaHSP70参与对高温胁迫抗逆反应和对病原真菌抗病防卫反应过程,我们将利用转基因植物对TaHSP70的生物学功能做进一步验证,以明确该基因在小麦抗病和抗逆过程中的调控功能,此研究结果不仅丰富了小麦热激蛋白HSP70家族基因的研究内容,也为小麦抗性改良研究提供有参考价值的线索。3材料和方法3.1国民公园的材料以含Yr5抗条锈病基因近等基因系Taichung29*6/Yr5为供试材料,构建了非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的cDNA文库,以上材料均为中国农业科学院植物保护研究所麦病组创制、收集和保存;实验中所需引物由北京三博远志生物技术公司合成,所用的EasyTaq酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、Peasy-T3载体、质粒提取试剂盒、RNA反转录试剂盒均购自北京全式金生物技术公司,大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司,DNA测序工作由北京博尚生物技术公司完成。3.2扩增探针pcr利用目的基因家族的保守结构域序列设计引物,以文库为模板进行PCR扩增,获得目的基因同源序列片段,并以获得的片段为探针进行文库筛选,克隆该基因全长cDNA序列。3.3小麦幼苗中cy基因表达分析取温室(15~18℃)生长7d的Taichung29*6/Yr5幼苗,并做如下处理:(1)将小麦幼苗置