第四章蛋白质的共价结构

第四章蛋白质的共价结构蛋白质相对分子质量：6000-1×106单体蛋白:由1条肽链构成，如溶菌酶和肌红蛋白寡聚蛋白：由2条或多条肽链组成，如血红蛋白和己糖激酶。

寡聚蛋白每条肽链称为亚基。超分子复合体：烟草花叶病毒，2130个亚基和一条RNA链组成。一、蛋白质的分子大小蛋白质相对分子量和氨基酸残基数目的关系：氨基酸残基数=Mr/110二、蛋白质结构的组织层次一级结构二级结构三级结构四级结构三、肽肽是氨基酸的线型聚合物，也称肽链（peptidechain）

（一）肽和肽键的结构蛋白质中氨基酸的连接方式是肽键，实验证据有：蛋白质分子中游离α-氨基和α-羧基是很少的。某些人工合成的多肽能被水解蛋白质的蛋白酶所水解。双缩脲颜色反应X射线衍射图案二肽(dipeptide)、寡肽(oligopeptide)、多肽(polypeptide)、氨基酸残基(aminoacidresidue)、末端氨基、环状肽(cyclicpeptide)规定从肽链的NH2为某氨基酰某氨基酰……某氨基酸。Ser—Gly—Tyr—Ala—Leu通常在总是把NH2末端氨基酸残基放在左边，COOH末端氨基酸残基放在右边，除特别指明者外。肽链的骨干是由—N—Ca—C---序列重复排列而成，称为共价主链。由于酰胺氮上的孤电子对离域与羰基轨道重叠，因此在酰胺氮和羰基氧之间发生共振相互作用(resonanceinteraction)。肽键共振产生几个重要结果：①限制绕肽键的自由旋转。②组成肽基的4个原子和2个相邻的C形成所谓多肽主链的酰胺平面(amideplane)，也称肽基平面或肽平面。③C=N键长度为0.133nm。估计C—N键具有约40%双键性质。由于C—N具有部分双键性质，绕键旋转的能障比较高。对肽键来说，这一能障在室温下足以防止旋转，保持酰胺基处于平面。④肽键具有永久偶极。肽平面（二）

肽的物理和化学性质短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14范围内，肽键中的酰胺氢不解离。（三）

天然存在的活性肽α—鹅膏蕈碱还原型谷胱甘肽

γ—谷氨酰半胱氨酰甘氨酸还原型和氧化型谷胱甘肽四、蛋白质测序的策略蛋白质的共价结构也称蛋白质的一级结构，一般看作是氨基酸序列的同义语。现在已知约100000个不同蛋白质的氨基酸序列，相当一部分使用Sanger法测定的，现在大多数是根据编码蛋白质的基因核苷酸序列推导出来的。纯度应在97%以上，同时必须知道它的相对分子质量。①

确定蛋白质分子中多肽链的数目②

拆分蛋白质分子的多肽链（若是寡聚蛋白则需用变性剂8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理）③断开多肽链内的二硫键（用氧化剂或还原剂）④

分析每一条多肽链的氨基酸组成⑤

鉴定多肽链的N-端和C-端氨基酸残基⑥

裂解多肽成较小的片段⑦

测定各肽段的氨基酸序列⑧

重建完整多肽链的一级结构⑨

确定二硫桥的位置五、蛋白质测序的一些常用方法（一）

末端分析1.

N-末端分析二硝基氟苯（DNFB,FDNB）法丹磺酰氯（DNS）法（比DNFB法灵敏度高100倍）苯异硫氰酸酯（Edman试剂）法氨肽酶法苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法）氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。但由于酶的特异性和对各种氨基酸水解速度不用，结果往往不易判断，在实际应用中容易导致错误结论。2.

C-末端分析肼解法

羧肽酶法

羧肽酶是一种肽链外切酶，能从多肽链的C端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C末端残基顺序。实际应用时，由于羧肽酶对不同的C末端氨基酸作用的速度不同，而且反应是连续的，不能停在某一步上，因此给正确判断氨基酸的顺序造成了一定的困难。羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法(二)二硫桥的断裂过甲酸氧化法和二硫苏糖醇（DTT）还原法。（三）氨基酸组成的分析完全水解的氨基酸用氨基酸分析仪测定。（四）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化最有效地Edman化学降解法一次只能连续降解几十个残基，因此须先将长的多肽链水解成较小的肽段。酶裂解法胰蛋白酶糜蛋白酶嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶葡萄球菌蛋白酶水解的专一性不同蛋白酶的不同水解位点化学裂解法溴化氰(cyanogenbromide)只断裂由甲硫氨酸残基的羧基参加形成的肽键。用羟胺断裂：Asn—Gly之间的肽链、Asn—Leu及Asn—Ala键。（五）肽段氨基酸序列的测定Edmen化学降解法

酶降解法3.外肽酶：氨肽酶和羧肽酶（六）肽段在多肽链中次序的决定

（七）二硫键位置的确定对角线电泳用胃蛋白酶水解蛋白成较小片段，将样品点在滤纸中央

(七)蛋白质测定举例（自学）（八）

蛋白质序列数据库（自学）（九）肽与蛋白质的合成——固相合成（自学）六、根据核苷酸序列的推定法①是用待测的蛋白质作抗原免疫动物，得相应抗体；②用此抗体去沉淀此种蛋白质的多核糖体(polys