测定蛋白质含量和相对分子质量的方法

测定蛋白质含量的方法1、凯式定氮法（Kjedahl法）；2、福林（Folin）酚试剂法（Lowry法）；3、双缩脲法；4、染料结合法（Bradford法）5、紫外分光光度法；6、BCA比色法1、 凯式定氮法原理：在催化剂（如CuSO4,k2so4等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解为co2和h2o,其中的氮转变为氨，并进一步生成（NH4）2SO4,这个过程称为消化。在消化后的样品中，加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借助蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液，再用标准的盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。优点：1、是一种测定蛋白质含量的经典方法，操作相对简单；2、实验费用较低。缺点：1、最终测定的是总有机氮，而不是蛋白质氮；2、耗时较长；3、试剂具有腐蚀性。适用范围：可用于所有食品的蛋白质分析2、 福林（Folin）酚试剂法此法的显色原理与双缩服方法相同，只是加了第二种试剂，即Folin酚是试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：（1） 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。（2） Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。优点：灵敏度高，操作简单，不需要特殊仪器设备。缺点：费时长，需要精确控制操作时间，标曲也不是严格的直线形式，专一性差，干扰物质较多。测定蛋白质的浓度范围是25〜250四g/mL。3、 双缩脲法名词解释：是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般含有两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩服反应，而生成紫红色或蓝紫色的复合物，利用这个反应借助分光光度计可以测定蛋白质的含量。（2肽只有一个肽键，故要发生双缩脲反应至少是三肽）原理：紫色络合物颜色的深浅与蛋白浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可以用来测定蛋白质的含量。测定的干扰物质有：硫酸氨、Tris缓冲液和某些氨基酸等。优点：较快速，干扰物质较少。缺点：颜色变化不明显，不太灵敏。测定蛋白质的浓度范围是0.5~10mg/mL。4、 染料结合法该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250试剂反应，产生一种亮蓝色的化合物，在595nm有最大吸收。在一定的浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间有线性关系，因此可用于蛋白质的定量测定。注意：未结合蛋白质之前，染料试剂本身为棕褐色，在465nm有吸收。该法优点：快速，简便，干扰因素少。该法缺点：测定的蛋白质溶液浓度不能太高。5、 紫外分光光度法蛋白质分子中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在280nm处有特征性的最大吸收峰，可用于置白质的定量。优点：此法简便、快速、不损失样品。缺点：若样品中含有其他具有紫外吸收的杂质，如核酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。测定蛋白质的浓度范围是0.1~0.5mg/mL。6、 BCA比色法其原理是在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试剂（4,4'-二羧酸-2,2'-二哇啉钠）生成紫色复合物，于562mm处有最大吸收，其强度与蛋白质浓度成正比。优点：此法最大特点是：TritonX-100、SDS等表面活性剂无干扰作用，其他优点是：简便、快速、灵敏，可望替代传统的Lowry法。缺点：试剂较贵。测定蛋白质相对分子质量（Mr）的方法1、凝胶过滤法；2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法；3、沉降分析法（超离心沉降法）4、根据化学组成测定最低相对分子质量；5、渗透压法1、 凝胶过滤法原理：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样由不同大小的分子所经路径不同而得以分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。优点：方法准确，操作方便，重现性好。缺点：操作的技术要求较高，耗时较长。适用范围：只适用于测定球状蛋白分子的相对分子质量。（蛋白质分子流经凝胶珠的速度并不直接取决于分子的质量，而是他的斯托克半径。利用凝胶过滤测定蛋白质相对分子质量时，标准蛋白（已知Mr和斯托克半径）和待测定蛋白必须具有相同的分子形状，接近球体，否则不能得到比较准确的Mr。分子形状为线型的或与凝胶珠能产生吸附作用的蛋白质则不能够用此法测定Mr。）2、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法简介与比较：SDS：十二烷基硫酸钠——去污剂蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，他的迁移率取决于他所带的净电荷，以及分子大小和形状等因素。（没有加入SDS）若在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。（加入了SDS）原理：由于SDS是一种带负电荷的阴离子去垢剂，并且具有长长的疏水性碳氢链。这种性质不仅使得寡聚蛋白质的亚基拆离，而且还能拆开肽链的折叠结构，并且沿着伸展的肽链吸附在上面。这样吸附在肽链上带电荷的SDS分子使得肽链带净负电荷，并且吸附的SDS量与肽链的大小成正比。结果是，不同大小的肽链将含有相同或几乎相同的q/r值。由于聚丙烯酰胺凝胶基质具有筛分效应，所以分子较小的肽链将比较大的，但具有相同的q/r值的肽链迁移的更快。优点：设备简单，分离时间短。缺点：单体聚丙烯酰胺具有毒性，会对神经系统以及皮肤等产生不良影响，且影响因素较多。3、沉降分析法（笔记第23页）原理：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降。沉降的速度与蛋白质分子大小和密度有关。利用超速离心机测定蛋白质或其他生物大分子的相对分子质量，不同的蛋白质由于其分子大小不同，在一定的离心力场中沉降的速度也不同。（纯的蛋白质溶液中只含有分子质量和形状相同的蛋白质分子，在离心场作用下，他们都是以同一沉降速度移动，因此在蛋白质溶液与溶剂之间有一个清晰界面。在沉降分析图谱上呈现一个峰。如果蛋白