球孢白僵菌未干燥孢子粉和冻干孢子粉贮藏性能的比较

球孢白僵菌未干燥孢子粉和冻干孢子粉贮藏性能的比较

1白陷菌的药物代谢养分、蛋白质和养分不仅存在于细菌的营养丝中，而且作为一种重要的能量储备也存在于菌株中。这些养分分布在与膜结合的液体泡沫中，或以游离的形式存在在细胞中，或与细胞一起结合在一起。例如，在外部营养不足的情况下，c-和n型源可以缓慢代谢并开始发育。此前，在各种真菌的胚胎中检测到这些化合物及其代谢活动，但对白僵尸菌及其代谢的研究很少。例如，糖和蛋白质等。球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin)是一种重要的杀虫真菌,在国外已被开发成为多种商品化杀虫制剂,用于防治多种农林害虫.孢子粉是研制白僵菌各种剂型的基础,其含水量作为影响孢子活性的重要参数倍受重视,因为孢子粉含水量过高会导致孢子提前萌发和自溶.然而,白僵菌孢子在贮存过程中的活力与内贮营养物的代谢变化及其条件仍知之甚少,以致延长孢子粉贮存期的若干努力收效甚微.在本研究中,作者通过在不同含水量和温度组合条件下贮存球孢白僵菌孢子粉期间定期检测孢子内贮多糖和蛋白质的代谢水平及活孢率,探讨了该菌孢子在贮存过程中营养生理的变化规律以及含水量、贮存温度对孢子活力的影响.2材料和方法2.1孢子粉的制备球孢白僵菌BBSG8702菌株自病死蚜尸分离而得,在4℃冰箱中保存于萨氏培养基平板上.孢子粉的生产采用两相发酵法.种子培养基为萨氏培养液(葡萄糖4%加蛋白胨1%),产孢培养基配方为2%玉米粉、1%麸皮、0.5%蛋白胨、0.3%KH2PO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.1%NH4NO3及2%琼脂.在实验室生产两批孢子粉.第一批孢子粉一分为二,一份不干燥,也不进行任何加工处理(简称未干燥粉);另一份直接放进12LS型冷冻干燥机(VirTisCompany,NewYork,USA)中进行真空冷冻干燥,制成冻干粉.真空冷冻干燥的程序是:先将孢子粉放入已预冷至-48℃的真空冷冻干燥仓中,经1h升温至-46℃,维持9h后经2h升温至-28℃,维持6h后经2h升温至-8℃,维持4h后经20min升温至5℃,维持4h后经2h升温至25℃,在此温度维持6h后干燥结束,总计36h.未干燥粉和冻干粉的含水量测定参照殷凤明等。第二批孢子粉全部按相同程序进行真空冷冻干燥,使含水量降至5%以下.2.2冻干粉贮藏期测定指标将第一批生产的未干燥粉和冻干粉分别贮存于4℃和20℃恒温下,贮存开始前取样测定孢子粉的总糖和蛋白质含量及萌发率,贮存后每隔5d取样测定相同指标,持续1个月.第二批生产的冻干粉同样分别贮存于4℃和20℃恒温下,持续1年每隔15d取样测定活孢率,以考查低含水量孢子粉的贮存寿命.2.3生理指标的测量2.3.1添加1.2.2dnah精确称取未干燥粉20mg和冻干粉10mg,分别加入10ml3mol·L-1HCl,沸水浴水解15min.继之,水解液中加入5ml6mol·L-1NaOH,摇匀并过滤。过滤液用0.2mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.0)定容至50ml.糖含量测定参照蔡成武和袁厚积的方法.每样品重复3次,以蒸馏水为空白对照,葡萄糖为标准.按孢子粉含水量,将总糖含量换算成单位重量干孢子粉的含量(μg·mg-1).2.3.2蛋白质含量测定精确称取未干燥粉20mg和冻干粉1Omg,分别加入2m10.5mol·L-1NaOH,沸水浴水解15min.然后,在水解液中加入1ml1mol·L-1HCl,摇匀过滤,滤液用0.2mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.0)定容至5ml.蛋白质含量测定按Braford的方法进行.每样品重复3次,以蒸馏水为空白对照,以牛血清白蛋白为标准.按孢子粉含水量,将蛋白含量换算成单位重量干孢子粉的含量(μg·mg-1).2.3.3权利不足营养液和水剂制备出芽孢杆菌1.取样品孢子粉少许,加入5ml无菌水中,配制成107个·ml-1孢子的悬液.各取1ml孢子悬液分别加入9ml营养液(蔗糖2%和蛋白胨0.5%)和9ml无菌水中(即稀释10倍),经恒温(25±1℃)振荡(100r·min-1)培养24h,测定孢子在营养液和清水中的萌发率.2.4用培养基糖作为总糖和蛋白质含量的培养基将供试菌株接种于玉米麦麸(浸汁)培养液中,于25±1℃下振荡(100r·min-1)培养3d,过滤收集菌丝并用缓冲液清洗.将所得的菌丝置于120℃下烘至恒重,按前述方法测定菌丝总糖和蛋白质的含量,作为孢子内贮总糖和蛋白质的比较.2.5数据分析本研究中的方差分析、相关分析及模型模拟等数据分析工作均采用唐启义和冯明光的DPS软件在计算机上完成.3结果与分析3.1不同贮藏温度对孢子粉总糖、总糖含量的影响经测定,第一批未干燥粉的含水量为58.93±1.57%,冻干粉的含水量为7.39±0.85%.孢子粉中总糖含量为177.79±2.61μg·mg-1,蛋白含量为109.87±5.34μg·mg-1.菌丝中总糖含量为641.54±9.81μg·mg-1,蛋白含量为181.42±5.88μg·mg-1.在不同含水量和贮存温度组合下,孢子粉中总糖和蛋白质的代谢及活孢率的变化见图1所示.对孢子粉中内贮蛋白和总糖的下降幅度(表1)进行方差分析显示,不同含水量处理(未干燥粉和冻干粉)间存在极显著差异(F=216.60;F=778.15,P<0.01),而贮存温度间差异不显著(F=0.11;F=0.49,P>0.05).换句话说,贮存温度对每种孢子粉内贮蛋白含量影响极小,而孢子粉含水量是影响内贮蛋白及总糖含量下降的主要因素.另一方面,孢子粉在清水和营养液中萌发率的下降幅度不仅在不同含水量的孢子粉间存在极显著差异(F=512.18;F=2351.75,P<0.01),而且在不同贮存温度间也存在极显著差异(F=31.68;F=2396.62,P<0.01).同内贮营养的变化类似,在4℃和20℃下贮存,未干燥粉在清水中萌发率的下降幅度远大于冻干粉,而两种贮存温度的影响差异不显著(均下降96%以上),但温度对冻干粉在清水中萌发率的下降影响显著.于20℃下贮存的未干燥粉在营养液中萌发率的下降幅度远大于4℃下的未干燥粉和两种温度下贮存的冻干粉.3.2菌粉在营养液和不同贮藏温度下的萌发率将贮存期间孢子粉在清水中的萌发率与其内贮总糖及蛋白含量之间进行相关分析,结果显示,在4℃下贮存的未干燥粉和冻干粉,其孢子在清水中的萌发率不仅分别与孢子内贮蛋白含量显著相关(r=0.98,P<0.01;r=0.89,P<0.01),而且与内贮总糖含量也显著相关(r=0.95,P<0.01;r=0.96,P<0.01).在20℃下,两种孢子粉在清水中的萌发率均与内贮总糖含量存在显著或极显著的相关性(冻干粉:r=0.77,P<0.05;未干燥粉:r=0.92,P<0.01),也与孢子内贮蛋白含量有一定相关性(冻干粉:r=0.68,P=0.09;未干燥粉:r=0.78,P<0.05).在4℃下贮存的未干燥粉和冻干粉在营养液中的萌发率与孢子内贮蛋白含量显著或极显著相关(冻干粉:r=0.86,P<0.05;未干燥粉:r<0.99,P<0.01),同时也与内贮总糖含量显著或极显著相关(冻干粉:r=0.77,P<0.05;未干燥粉:r<0.95,P<0.01).在20℃下贮存期间,两种菌粉在营养液中的萌发率均与孢子内贮总糖及蛋白含量显著或极显著相关(r为0.85～0.95,P<0.05).在不同贮存温度下,两种孢子粉在清水和营养液中的孢子萌发率均存在显著或极显著线性关系(4℃下冻干粉:r=0.82,P<0.05;20℃下冻干粉:r=0.89,P<0.01;4℃下未干燥粉:r=0.95,P<0.01;20℃下未干燥粉:r=0.78,P<0.05),回归斜率分别为0.25、0.22、0.12和1.51.这表明贮存温度和含水量不同的孢子粉在有无营养条件下的萌发率变化不同步,其中20℃下贮存的未干燥粉在营养液中的萌发率在贮存的前10d并不像在清水中那样陡降,而是在贮存10d之后才急剧下降(图1).3.3冻干粉贮存期间活孢率的变化第二批生产的未干燥粉含水量为58.56%(±1.92%),经真空冷冻干燥后含水量降为3.97%(±0.93%).这批冻干粉在4℃和20℃下贮存1年期间活孢率的变化见图2所示。在4℃下贮存的低含水量冻干粉的活孢率在贮存过程中下降极为缓慢,一年中活孢率仅从99.8%下降至90.2%.而在20℃下贮存的同样孢子粉,活孢率在前165d下降较为缓慢,但此后急剧下降,至第240d时几乎全部失活.方差分析表明,在贮存的前135d期间,两种温度下的活孢率无显著差异,此后4℃下的活孢率极显著地高于20℃下的活孢率.用逻辑斯蒂模型V=1/[1(exp(a+bd)]对冻干粉在两种温度下贮存期间的活孢率(V)与贮存天数(d)间的关系进行模拟分析,模型拟合良好,4℃下的确定系数(r2)为0.86(F=138.5,P<0.01),20℃下的确定系数达0.99(F=1927.6,P<0.01).用所获参数估计值建立的模型能很好地拟全20℃下贮存后期活孢率的急剧下降,但贮存前期的模拟值则比观察值偏高(图2).在20℃下,冻干粉贮存1年后仍保持很高活力,所获模拟值与观察值差异甚微.用所建立的模型估计出冻干粉在4℃和20℃下贮存的半衰期(即活孢率减少一半所需的时间)分别为1006d和197d.这些结果表明,即使含水量低于5%的白僵菌纯孢粉,也只能在低温下才能较安全地保存,而常温下的安全保存期仅5个月左右.4孢子粉在不同温度下贮藏期间含水量的变化球孢白僵菌在不同C源条件下培养的干菌丝中多糖和蛋白质的总含量相对恒定,为852.40±30.99μg·mg-1.笔者测得的该菌菌丝中总糖含量为641.54±9.81μg·mg-1,蛋白质含量为181.42±5.89μg·mg-1,二者之和为822.97μg·mg-1,约占菌丝重量的82%.孢子粉中总糖含量为177.79±2.61μg·mg-1,蛋白质含量为109.87±5.34μg·mg-1,二者之和为287.66μg·mg-1。可见,球孢白僵菌只是将营养生长阶段的部分营养贮备在孢子中.这是由于菌丝和孢子的生理功能不同,致使孢子内贮营养总量有别于菌丝体.孢子从形成开始,便不与营养菌丝发生物质和能量的交换.在多种真菌中,孢子可通过储备营养的缓慢代谢而维持孢子的活力,以等待适宜条件的到来侵染寄主;到此时,储备营养又为孢子萌发提供可利用的C、N源.在本实验中,白僵菌孢子的总糖及蛋白质含量在贮存过程中均有不同程度的下降,这表明孢子从离开培养基开始,也通过缓慢代谢内贮营养的方式抵抗无外源营养的不利状态.含水量相同的孢子粉在不同温度下贮存,其内贮营养物质含量下降幅度的差异并不显著.仅从孢内营养物质含量下降幅度看,孢子粉的含水量能显著地影响孢子内贮营养(糖、蛋白)的代谢,而温度影响却不显著(表1).然而,在贮存期间的不同时段,孢子内贮营养物质的下降幅度却不同.贮存于4℃的孢子粉,其内贮营养物质含量的下降较为平缓,而在20℃下贮存的孢子内贮营养物质要经历一个较快下降过程才趋于平缓(图1).显然,孢子粉的含水量影响孢内代谢的液相环境,含水量越高孢内物质代谢越快;温度影响代谢的进程,在一定温区内温度的升高可提高孢内酶活而加快代谢,使孢内营养物质较快地被消耗.孢子在有无营养条件下的萌发率均与孢内营养代谢有关,孢子粉的含水量和贮存温度影响它们之间的相关程度.尽管含水量不同,在两种温度下贮存的孢子粉在无营养条件下的萌发率均与多糖和蛋白质代谢有较为密切的关系.这是因为多糖为孢子的生存提供能量,蛋白质(包括酶蛋白)参与代谢,其含量下降应主要包括代谢和自溶部分.因此,4℃的低温只能延缓而无法阻止孢内营养的代谢,可防止酶蛋白失活,从而阻止孢子失活.一旦能量耗尽和酶蛋白开始自溶,孢子的失活便不可避免.在20℃下贮存的冻干粉和未干燥粉,其萌发率与糖及蛋白质代谢间的密切关系正好为此作出解释.孢子粉在营养液中的萌发率能反映孢子粉的活孢率.高贮存温度和高含水量组合对孢子存活极端不利,如未干燥粉在20℃下半衰期仅约为13.5d(图1-D);而低温和低含水量则大大延长半衰期,冻干粉在4℃下贮存一年的活孢率变化(图2)就是有力的证明,其模拟的半衰期达1006d.然而,含水量低至3.97%的冻干粉在常温下的有效贮存(活孢率(85%)时间仅165d,半衰期仅197d(图2),说明只降低孢子粉的含水量难以实现常温下有效贮存1年以上的设想.孢子粉的含水量及贮存温度均显著影响孢子在有无外源营养条件下的萌发率,且存在互作.贮存伊始,孢子在营养液中的萌发率显著高于清水中的萌发率(图1).在贮存过程中,营养液中的萌发率与清水中的萌发率显著相关,但变化趋势并不平行.因此,孢内营养的多寡并不决定孢子有无活力,孢内营养的耗尽并不意味着孢子丧失活力,此时供给外源营养孢子仍可萌发.真正引起孢子失活的原因可能是孢内酶蛋白的自溶和代谢废物的自抑作用.于是,在设计白僵菌制剂配方时添加合适的糖源和N源将有利于提高活孢率及有效成分(侵染性孢子)的利用率.最后