药物分析第4章 药物的定量分析与分析方法的验证

第四章

药物定量分析与分析方法验证药物分析教研室Contents定量分析样品的前处理方法1定量分析方法的特点2药物分析方法的验证3生物样品分析方法的基本要求42一、概述定量分析方法选择的依据：分析方法的特点；化学原料药的结构与性质；药物制剂的处方组成。具有特征结构的化学原料药—容量、分光光度、色谱药物制剂—处方中干扰组分的排除本节：含金属或含卤素、硫、磷、硒等特殊元素药物有机卤素药物：指药物结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些药物的卤酸盐或氢卤酸盐。含金属的有机药物及有机金属药物第一节定量分析样品的前处理方法Pretreatmentofsampleusedinquantitativeanalysis3第一节定量分析样品的前处理方法含卤素药物C—X乙烯型卤和芳卤烯丙型卤和苄卤卤代烷型卤素活泼性I＞Br＞Cl＞F分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强；同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显4三氯叔丁醇（防腐剂）六氯对二甲苯血防-846（广谱抗寄生虫）泛影酸（造影剂）碘他拉酸（造影剂）第一节定量分析样品的前处理方法5第一节定量分析样品的前处理方法不经有机破坏经有机破坏直接测定配位滴定法氧化还原滴定法水解后测定碱水解：卤素酸水解：金属经还原分解后测定：含碘有机药物湿法破坏——凯氏定氮法干法破坏高温灼烧法：含卤素或磷、硒金属氧瓶燃烧法6第一节定量分析样品的前处理方法(一)直接测定法葡萄糖酸钙EDTA配位滴定富马酸亚铁邻二氮菲-硫酸铈滴定葡萄酸锑钠间接碘量法适用范围：金属原子不直接与碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。7第一节定量分析样品的前处理方法1、碱水解法三氯叔丁醇银量法返滴定2、酸水解法适用范围：含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物。EDTA配位滴定(二)经水解后测定法8第一节定量分析样品的前处理方法(三)经还原分解后测定法适用范围：碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物。9第一节定量分析样品的前处理方法三、经有机破坏的分析方法

含氮、硫、硫柳汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。

H2SO4-HNO3H2SO4-HClO4H2SO4-MSO4HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂——凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结构的药物结构(一)湿法破坏10第一节定量分析样品的前处理方法原理

将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。

常量法——含氮量25～30mg

半微量法——含氮量

1.0～2.0mg11第一节定量分析样品的前处理方法凯氏烧瓶K2SO4(提高消解温度)CuSO4(加快消解速度)硫酸碱液硼酸(吸收液)甲基红-溴甲酚绿指示剂硫酸滴定空白校正12凯氏定氮反应原理1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，消化生成(NH4)2SO4反应式为：H2SO4==SO2+H2O+[O]R.CN.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O2NH3+H2SO4==(NH4)2SO42.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3

溶液中反应式为：2NH4++OH-==NH3+H2ONH3+H3BO3==NH4++H2BO3-3.再用已知浓度的H2SO4标准溶液滴定，根据H2SO4

消耗的量计算出氮的含量

常量法：每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L）相当1.401mg的氮

半微量法：每1ml硫酸滴定液（0.005mol/L）相当0.1401mg的氮4.蛋白质含量计算：氮含量乘以相应的换算因子(6.25)，既得蛋白质的含量。反应式为：H2BO3-+H+==H3BO313(二)干法破坏1.高温灼烧法用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。2.氧瓶燃烧法第一节定量分析样品的前处理方法系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。14第一节定量分析样品的前处理方法药物产物吸收液测定方法含FHF水（F-）茜素氟兰比色含ClHClNaOH溶液（Cl-）银量法、汞量法含BrBr2、HBrNaOH溶液-SO2饱和溶液（Br-）含II2、HIO3、HIONaOH溶液-SO2饱和溶液（NaI）银量法、汞量法NaOH溶液（NaIO3、NaI）Br-HAc溶液（HIO3）KI（I2）碘量法比色法含sSO3浓H2O2溶液（H2SO4）Ba沉淀（重量法）含PP2O5水（焦磷酸、偏磷酸）+硝酸→磷酸比色法（磷钼蓝）含SeSeO2、SeO3硝酸溶液→硒酸（H2SeO4）二氨基萘比色15第一节定量分析样品的前处理方法16氧瓶燃烧法注意事项：（1）燃烧瓶：大小适宜、干净、有防爆措施（2）氧气要充足：燃烧完全（不得有黑色炭化物）（3）产生烟雾应完全被吸收：充分振摇烟雾颜色：碘，紫色；溴，红棕色；氟氯,白色（4）测定氟化物：石英制燃烧瓶17第一节定量分析样品的前处理方法示例碘苯酯的含量测定

取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOHT.S.2ml与H2O10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴蒸气，加KI2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代钠液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。18C19H29IO2分子量为416.34C19H29IO2——6Na2S2O3滴定度(T)=416.34×1/6×0.02=1.338(mg)第一节定量分析样品的前处理方法19第二节定量分析方法的特点一、容量分析方法1.滴定度每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物浓度。被测药物滴定液20第二节定量分析方法的特点直接滴定、生成物滴定剩余滴定21第二节定量分析方法的特点示例一Vc的含量测定碘量法测定Vc含量[M(C6H6O6)=176.13]，C(I2)=0.05mol/L示例二

异烟肼的含量测定溴酸钾法测定异烟肼含量[M(C6H7N3O)=137.14]，C溴酸钾=0.01667mol/L22第二节定量分析方法的特点示例三

葡萄糖酸锑钠的含量测定0.3g供试品＋水100ml＋盐酸15ml＋碘化钾试液10ml密塞，振摇后暗处放置10min碘量法Sb5+——2S2O32-23示例四

司可巴比妥钠的含量测定第二节定量分析方法的特点取本品约0.1g，精密称定，置250ml碘瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml，再加盐酸5ml，立即密塞，并振摇1min，在暗处放置15min后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10ml，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定得的结果用空白试验校正。M=260.23司可巴比妥—溴=1:1W=0.1022g；F=1.038；V=15.73mlV0=23.2124第二节定量分析方法的特点习题一剩余碘量法测定异烟肼含量

异烟肼在弱碱性溶液中，加定量过量的碘滴定液(0.1mol/L)氧化，反应完成后，酸化，剩余碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定(以淀粉为指示剂)。25第二节定量分析方法的特点习题二非那西丁含量测定精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00ml。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N，请计算非那西丁的含量。26第二节定量分析方法的特点二、光谱分析法(一)紫外-可见分光光度法

仪器校正空白溶剂校正吸收峰波长确定A－(0.3~0.7)27第二节定量分析方法的特点含量测定方法1.对照品比较法原料药固体制剂液体制剂282.吸收系数法习题一维生素B2含量测定取本品75mg，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸1ml与水75ml，加热溶解后，加水稀释，放冷，移置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；精密量取10ml，置100ml量瓶中，加1.4%醋酸钠溶液7ml，并用水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法在444nm的波长处测吸收度，按维生素B2的吸收系数为323计算第二节定量分析方法的特点29第二节定量分析方法的特点3.计算分光光度法4.比色法30特点：灵敏度高，可达10-10～10-12g/ml要求低浓度下测定须做空白测定荧光弱的药物可衍生化后测定第二节定量分析方法的特点(二)荧光分析法31第二节定量分析方法的特点三、色谱分析法（一）HPLC对仪器的一般要求和色谱条件色谱柱检测器流动相系统适应性试验理论塔板数分离度重复性拖尾因子32HPLC3.测定方法内标校正因子法

外标法33示例一炔诺酮的含量测定照高效液相色谱法(附录ⅤD测定)色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(65:35)为流动相，检测波长为244nm。理论塔板数按炔诺酮峰计算不低于1500，炔诺酮峰与内标物质峰的分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求。内标溶液的制备取黄体酮约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。HPLC34HPLC测定法

取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液2ml与内标溶液3ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱仪，记录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。352.GC第二节定量分析方法的特点示例松节油的含量测定

照气相色谱法(附录ⅥE测定)色谱条件与系统适用性试验

用聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布密度为20%；柱温为90℃。理论塔板数按α-蒎烯峰计算应低于1500。校正因子测定取正丁醇适量，精密称定，加石油醚(30～60℃)制成每1ml含20mg的溶液，作为内标溶液。另取α-蒎烯对照品约30mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，精密加入内标溶液2ml，加石油醚(30～60℃)至刻度，摇匀，吸取1μl注入气相色谱仪，计算校正因子。36第二节定量分析方法的特点测定法

取本品约35mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，精密加入内标溶液2ml，用石油醚(30～60℃)溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl注入气相色谱仪，测定，即得。本品含α-蒎烯(C10H16)不得少于70%。37第三节药品分析方法的验证药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则微囊、微球与脂质体制剂指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则目的：

证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标：

评价分析方法的尺度

效能指标包括:

精密度,准确度,检测限,定量限,选择性,线性与范围,耐用性38第三节药品分析方法的验证一、准确度（accuracy）

系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。(一)含量测定方法回收率(Recovery)回收试验加样回收试验3×3，至少9个测定结果39第三节药品分析方法的验证二、精密度(Precision)

系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。表示：偏差(d)、标准偏差(s),、相对标准偏差(RSD)重复性:

同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:

同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度

重现性:

不同实验室，不同人测定的精密度40第三节药品分析方法的验证三、专属性(Specificity)

指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。目视法信噪比法

S/N=3四、检测限(LimitofDetection,LOD)药物能被检出的最低浓度(µg/ml)五、定量限(LimitofQuantitation,LOQ)药物能被定量测定的最低浓度(µg/ml)信噪比法

S/N=1041第三节药品分析方法的验证影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等六、线性与范围(LinearityAndRange)待测结果(响应值)与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度。

Y=a+bx（r=0.9999)七、耐用性(Robustness)测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度42第三节药品分析方法的验证①①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充②③视具体情况予以验证③43第三节药品分析方法的验证各种含量测定方法对效能指标的要求1.容量分析法

用原料药精制品(含量>99.5%)或对照品考察方法的精密度，RSD≤

0.2%

；回收率一般在99.7～100.3%之间。

2.UV法

用适当浓度的精制品进行测定，其RSD≤1%

。制剂的测定，回收率一般应在98～102％之间。3.HPLC法

要求RSD<2％，回收率98～102%之间。44第四节生物制品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏(一)血样

①血浆(plasma)②血清(serum)③全血(二)唾液(三)尿液

用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。45第四节生物制品分析方法的基本要求二、生物样品分析前处理技术全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取RIA残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS46蛋白质的去除加入与水混溶的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)缀合物的水解酸水解(盐酸)酶水