热点微专题07 PCR技术拓展和应用（解析版）

PCR技术拓展和应用【核心知识回顾】1、利用PCR获取和扩增目的基因①原理。②基本条件：a、场所：在一定的溶液中进行，其中一般要添加；b、模板：DNA母链；c、原料：4种；d、酶：的DNA聚合酶；e、引物：种，使DNA聚合酶能够从引物的端开始连接脱氧核苷酸。③扩增过程过程说明图解变性温度超过℃时，双链DNA解聚为单链温度下降到50℃左右时，种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链④鉴定：常采用来鉴定PCR的产物。参考答案：①DNA半保留复制②缓冲Mg2＋脱氧核苷酸耐高温23'③90℃复性两72℃耐高温的④琼脂糖凝胶电泳【典型例题】1、下列有关PCR技术中引物的叙述，正确的是()A、引物是一小段DNA分子或双链RNA分子B、扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目C、两种引物之间能够发生碱基互补配对，两引物分别是子链延伸的起点，并可以反复利用D、DNA聚合酶只能从引物的5＇端连接脱氧核苷酸参考答案：B解析：引物是一小段单链DNA或RNA，可与DNA母链通过碱基互补配对进行结合，A错误；扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目，B正确；引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合，两种引物之间不能发生碱基互补配对，两引物参与构成子链，不能反复利用，C错误；DNA聚合酶只能从引物的3＇端连接脱氧核苷酸，D错误。2、(2021年湖北高考真题)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是()A、增加模板DNA的量 B、延长热变性的时间C、延长延伸的时间 D、提高复性的温度参考答案：D解析：多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。3、(2020·北京)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是()A、①＋③B、①＋②C、③＋② D、③＋④参考答案：B解析：引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。4．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是()A、用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列B、设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连C、复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D、第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16参考答案：D解析：用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。5、(2021·石家庄模拟)锦鲤疱疹病毒是一种双链DNA病毒。如图为TaqMan荧光探针技术的原理示意图，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时该探针被Taq酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增1个DNA分子，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。下列有关叙述不正确的是()A、在基因工程中，目前获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增等B、引物的化学本质是DNA单链C、引物中的GC含量比探针中的略高，这有利于保证退火时引物先与模板DNA结合D、若最初反应体系中只有一个病毒DNA分子，经n次循环后，需要消耗TaqMan荧光探针2n－1个参考答案：C解析：在基因工程中，目前获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增、利用化学方法人工合成，A正确；引物是根据目的基因合成的，一般是一段短的DNA单链，B正确；GC之间形成3个氢键，GC含量高的DNA更稳定，更难变性，但是对复性过程影响不大，C错误；由于每扩增1个DNA分子，就有一个荧光分子形成，经n次循环后共有2n个DNA，跟初始相比，新增2n－1个DNA，所以需要TaqMan荧光探针2n－1个，D正确。6、荧光PCR法根据化学发光原理可以分为染料法和探针法。染料法中特殊染料本身不发光，但是当PCR扩增的时候，染料能够与DNA双链结合从而发光，如图1所示。探针法中除了引物外另外设置了一个探针，在探针的两端分别带上发光基团和淬灭基团，此时发光基团并不发光，但是当DNA通过引物合成的时候，探针被酶切降解释放出发光基团和淬灭基团，两种基团分开后产生荧光，如图2所示。下列说法错误的是()A、两种方法均可用于目标DNA的定量分析B、与染料法相比，探针法的特异性更强C、通过适当延长引物长度和降低复性温度可提高荧光PCR的特异性D、用荧光PCR法检测人体是否感染新冠病毒前需要先进行逆转录参考答案：C解析：染料法中“染料能够与DNA双链结合从而发光”，探针法中“两种基团分开后产生荧光”，荧光强度和DNA含量成正相关，A正确；染料法中，染料不与单链DNA链结合，只要掺入DNA双链中就可以发光。探针法中，只有探针结合的片段上发生扩增才能发光，探针法的特异性更强，B正确；适当延长引物长度，和引物互补配对的特定DNA序列更长，能提高荧光PCR的特异性，降低复性温度，则引物和DNA序列更容易结合，可能发生错误配对，降低荧光PCR的特异性，C错误；新冠病毒的遗传物质是RNA，染料法和探针法都是检测DNA，检测人体是否感染新冠病毒前需要先进行逆转录，以病毒RNA为模板来合成DNA，D正确。7、用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如图所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是()A、第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B、第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C、第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因D、第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因参考答案：D解析：第一轮复制得到2个DNA分子，即①和②各一个，A正确；第二轮复制得到4个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，故得到①②③④各一个，B正确；第三轮复制得到8个DNA分子，①复制得到①和③，③复制得到③和⑤，②复制得到②和④，④复制得到④和⑤，故得到①②各一个，③和④各两个，⑤两个且等长，即2个X基因，C正确；第四轮复制得到16个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，两个③复制得到两个③和两个⑤，两个④复制得到两个④和两个⑤，两个⑤复制得到四个⑤，故第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。8、用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，x为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的()参考答案：D解析：利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5′端到3′端，据此依题意和图示分析可知，A、B、C均错误，D正确。9、(2022·山东·高考真题)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3'端”或“5'端”)。且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是。参考答案：(1)两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对

5'端使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连解析：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。10、(2021年福建高考真题)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。参考答案：(1)引物1和引物4解析：密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。11、(2020年江苏省高考生物试卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRI酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤I用的EcoRI是一种__________酶，它通过识别特定的__________________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得_________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）已知序列PCR引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。A、5′-AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′B、5′-AATTCCATG-----------CTGAATT-3′C、5′-GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′D、5′-TTGATACGO----------CGAGTAC-3′参考答案：(1)限制核苷酸序列(2)磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④(4)B解析：(1)EcoRI是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRI剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。12、已知HSA基因一条链两端的碱基序列为：5’—CTTCGAAATTC-HSA基因-TCTCCCGATCGG—3’请根据其两端碱基序列设计一对引物，引物Ⅰ、Ⅱ分别是：磷酸端﹣________﹣羟基端；磷酸端﹣______﹣羟基端。1个DNA分子经PCR扩增，第n次时需要消耗引物Ⅰ_____个。参考答案：CTTCGAAATTCCCGATCGGGAGA（引物I、II顺序可换）2n-1解析：PCR技术是以从生物材料中提取的DNA作为模板，利用引物寻找HSA基因的位置并进行扩增。故引物是基因两端的碱基序列。根据题意可知，引物Ⅰ为磷酸端﹣CTTCGAAATTC﹣羟基端；引物Ⅱ为磷酸端﹣CCGATCGGGAGA﹣羟基端（引物Ⅰ和引物Ⅱ顺序可互换）。1个DNA分子经PCR扩增，第n次时将具有DNA分子数为2n；第n-1次时将具有DNA分子数为2n-1；故第n次比第n-1次增加的DNA分子数为2n-2n-1=2n-1，故需要引物Ⅰ的个数为2n-1。13、获得目的基因后，需要通过PCR技术扩增。PCR反应中需要用的到酶是Taq酶

，其不能从头开始合成DNA，而只能____________________，因此PCR扩增需要引物。在扩增图乙目的基因时，与之对应的引物结合部位应该是图中的________（填数字）。为了使目的基因插入到pUC18质粒中，需要在引物的______端添加限制酶的识别序列。若计划用1个目的基因为模板获得m（m大于2）个目的基因，则需要的引物总量是________个。参考答案：从3’端延伸DNA链2、35’2m-2解析：Taq酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，因此PCR扩增需要引物。DNA分子中含游离的磷酸基团端为5′端，含游离羟基端为3′端；由于Taq酶只能从引物的3′端延伸DNA链，引物与目的基因所在DNA分子遵循碱基互补配对原则，所以扩增图乙目的基因时，与之对应的引物结合部位应该是目的基因所在DNA分子的3′端，即图中的2、3。为了使目的基因完整的插入到pUC18质粒中，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。若计划用1个目的基因为模板获得m(m大于2)个目的基因，因为每个新合成的目的基因的两条脱氧核苷酸链的两端都各含有一个引物，故m个基因应该有2m个引物，原来的模板链中不含引物，则需要的引物总量是2m-2个。14、变异链球菌在牙面的黏附、集聚是龋齿发生的先决条件。转基因防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因(PAcA基因)转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的基因工程疫苗。请回答下列相关问题：(1)转基因植物的制备单一使用PAcA基因，机体的免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列(CTB)，将CTB基因与PAc