磺酸二苯磺酸酯对红细胞毒性的研究

磺酸二苯磺酸酯对红细胞毒性的研究

磺酸是一种含有氨基丙烯酸的药物的总称。由于该药物的抗渗透性很高，因此其生产剂量只能是抗生素。目前，磺酰胺的使用量很大，属于抗高血压药物，对预防和控制动物疾病起到了重要作用。但是,关于它的毒副作用已有一些报道,如可引起雏鸡出现与维生素K缺乏有关的出血和组织坏死现象,亦可使鸡红细胞和淋巴细胞数减少,还可使禽类产蛋率下降,蛋壳变薄,引起小鼠多种器官的病理损伤等,该类药物残留在动物性食品中会使人发生变态反应、过敏反应等,对人类健康造成很大的威胁。目前,国内外研究主要集中在探索其检测方法和代谢机制等方面,对其毒性研究较少,本试验主要从毒理学角度研究该药物对小鼠红细胞免疫功能及骨髓微核率的影响,以补充磺胺喹啉的临床毒理学资料。1材料和方法1.1动物教育饲养动物中心健康昆明小鼠78只,体重为25～30g,雌雄各半,购自沈阳农业大学实验动物中心,动物状态良好,皮毛光泽,进食与活动正常。1.2实验试剂和试剂标准胎牛血清,购自中国医学科学院生物工程研究所;酵母试剂,购自Oxiod公司;Hank’s液,购自杭州四季青生物工程有限公司;肝素钠,购自中国医药集团上海化学试剂公司;淋巴细胞分层液,购自美国Sigma公司;环磷酰胺,购自山西泰盛制药有限公司。1.3灌胃对小鼠骨髓微核试验指标试验根据王进峰报道的半数致死量(LD50),将42只小鼠随机分成7组(见表1),每组6只,分笼饲养,连续灌胃给药2次,间隔时间为24h,于第2次灌胃6h后处死小鼠检测骨髓微核率。将剩余36只小鼠分成6组(除无阳性组外其余同表1),每日灌胃1次,2周后眼球采血检测红细胞免疫功能。1.4小鼠嗜多染红细胞微核试验将小鼠脱颈椎处死,取小鼠两侧股骨,剔去肌肉及碎片,剪去两端骨骺,用约0.05mL胎牛血清冲洗骨髓腔数次;将冲洗物滴到载玻片上,推片,在酒精灯上短时烘烤、干燥,甲醇固定7.5min,取出晾干;用1∶10的吉姆萨-磷酸缓冲液(pH值6.4)染色18min;用纯化水冲洗,干燥,再放入二甲苯透明6min;取出后趁湿滴上适量中性树脂,盖上盖玻片,镜检。每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞(PCE),并计算嗜多染红细胞微核率。计算公式:嗜多染红细胞微核率=含微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞×1000‰。1.5红细胞c3b受体的母环试验1.5.1酵母细胞悬液的配制将酵母试剂用Hank’s液洗1次(1000r/min离心10min),配成浓度为1×108个/mL的酵母细胞悬液;然后加等量新鲜豚鼠血清,混匀,37℃水浴20min,清洗2次,恢复原浓度,即为C3b致敏酵母细胞悬液。酵母试剂用Hank’s液洗涤后配成浓度为1×108个/mL的悬液,即为非致敏酵母悬液。1.5.2红细胞悬液的检测各试验组小鼠眼球采血,肝素抗凝,取适量抗凝血用Hank’s液洗3次,将洗涤后的红细胞用Hank’s液稀释成浓度为1.25×107个/mL的悬液,即为红细胞悬液。1.5.3in溶液配制取C3b致敏酵母细胞悬液和红细胞悬液各50μL,混匀,于37℃水浴40min后取出,轻轻摇动;加0.25%戊二醛溶液20μL,固定5min;用适量Hank’s液稀释,涂片,干燥,甲醇固定;用姬姆萨染液染色,高倍镜检查,以1个红细胞黏附2个或2个以上酵母细胞为1个花环,计数200个红细胞,求出花环率。1.6红细胞免疫化合物ic关于母环繁殖的试验除酵母细胞不致敏外,其余同红细胞C3b受体花环试验。1.7血液中的红细胞检测采用临床常规检验方法进行检测。1.8数据分析采用SPSS12.0统计学软件对试验数据进行单因子方差分析,用LSD进行多重比较,所有试验数据均用平均值±标准差表示。2结果与分析2.1对反应物微核率的影响镜下成熟正染红细胞(NCE)呈红色,嗜多染红细胞呈灰蓝色。阳性组与阴性组比较有统计学意义(P<0.01),试验可行。与阴性组比较,磺胺喹啉1/5LD50组和1/2LD50组微核率极显著升高(P<0.01),1/10LD50组显著升高(P<0.05),并呈现出一定的剂量-效应关系。具体见表2和图1。2.2红细胞免疫混合物花环率红细胞C3b受体花环率和IC花环率均是以1个红细胞黏附2个或2个以上酵母细胞为1个花环(如图2中箭头所示)。小鼠红细胞及红细胞免疫功能的变化见表3和图3～5。与阴性组比较,磺胺喹啉1/5LD50组和1/10LD50组C3b受体花环率均显著降低(P<0.05),并呈现出一定的剂量-效应关系。红细胞免疫复合物花环试验结果与阴性组比较没有统计学意义(P>0.05)。随着给药剂量的增加红细胞数量有降低的趋势,其中1/5LD50组和1/10LD50组显著低于阴性组(P<0.05),说明磺胺喹啉剂量过大可能会抑制小鼠红细胞的免疫功能。3磺酰胺啉及其应用在动物体内的残留问题自2005年起,农业部把畜产品中磺胺类药物的残留情况作为继盐酸克伦特罗之后的又一个重点予以监控,并规定磺胺类药物的总残留量不得超过300ng/mL,欧盟、日本、美国等西方发达国家制定的残留标准是100ng/g。中国加入世界贸易组织(WTO)后,世界各国均制定了相对严格的兽药残留标准。国外对我国出口的肉类产品提出了新的要求,在原有的10种磺胺类药物的检测基础上新增添了对磺胺喹啉的检测要求。美国食品与药品管理局(FDA)规定鸡的磺胺喹啉休药期为10d,并规定母鸡在产蛋期内禁用磺胺喹啉。而在国内,目前磺胺喹啉是我国农业部规定可以作为药物饲料添加剂使用的4种磺胺类药物之一,在畜牧业生产中使用量非常大,所以在动物性食品中残留情况也比较严重。本研究结果表明,磺胺喹啉灌胃剂量超过627.6mg/kg时会使小鼠骨髓微核率极显著升高(P<0.01),剂量达到313.8mg/kg就已表现出了显著性差异(P<0.05),并呈现出一定的剂量-效应关系,说明磺胺喹啉具有致突变作用。研究发现,某些磺胺类药物具有潜在的致癌、致畸、致突变性。欧仁福等研究发现,磺胺氯吡嗪钠灌胃剂量达到4.32g/kg时就会引起小鼠骨髓细胞微核率和精子畸形率呈极显著升高,二项指标均表现出了明显的剂量-效应关系,证明高剂量的磺胺氯吡嗪钠可对小鼠产生极强的致畸和致突变作用。美国“国家毒理研究中心”及N.A.Littlefield等都曾报道,磺胺二甲嘧啶可引起动物甲状腺增生及甲状腺滤泡细胞腺癌,还会减少大鼠甲状腺滤泡细胞分泌甲状腺球蛋白的量。红细胞免疫是机体一种重要的防御机制,红细胞可通过其表面的C3b受体黏附免疫复合物,是体内携带、运输及清除循环免疫复合物(CIC)的主要承担者,同时还具有促进吞噬、递呈抗原及激活补体等多种作用。在本试验中,磺胺喹啉灌胃剂量超过313.8mg/kg便使红细胞C3b受体花环率显著降低(P<0.05),而且表现出明显的剂量-效应关系,说明大剂量的磺胺喹啉可以使红细胞表面C3b受体黏附能力下降,从而抑制红细胞的免疫功能。王进峰研究发现,高剂量的磺胺喹啉可以使试验组小鼠的血红蛋白含量升高,并认为可能是磺胺喹啉破坏了大量红细胞,导致了红细胞数量的锐减,降低了血细胞比容,并促使血液中积存过多的血红蛋白。本研究中,随着磺胺喹啉剂量的升高,试验组小鼠红细胞数量显著减少,也证实了这一点。红细胞的大量破坏也必然加剧了红细胞免疫功能的降低。据报道,磺胺喹啉能够降低小鼠非特异性