氟桂利嗪对大鼠电刺激偏头痛模型nf-b蛋白表达的影响

氟桂利嗪对大鼠电刺激偏头痛模型nf-b蛋白表达的影响

头痛是一种常见的头痛疾病，可能导致工作能力的丧失。临床表现多样,发作时常伴有众多植物神经系统症状。流行病学研究表明它患病率高,对社会经济以及个人产生巨大影响。核因子-κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)是许多细胞功能的即早和普遍的转录因子,以p50/p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子。我们实验室之前的研究显示:电刺激大鼠上矢状窦(superiorsagittalsinus,SSS)区硬脑膜后,在对偏头痛发作起重要调控作用的中脑导水管周围灰质区(periaqueductalgray,PAG),出现了NF-κB细胞的激活,说明NF-κB蛋白在偏头痛的发生及发展过程中起到一定作用。目前有大量的关于钙通道与疼痛之间关系的研究。作为偏头痛非急性期的预防性药物-钙通道阻滞剂,如氟桂利嗪的应用已经相当广泛。目前国内尚没有与偏头痛相关的氟桂利嗪与NF-κB之间相互作用关系的研究结果。材料和方法1.氟桂利嗪组和盐水组电刺激方法使用健康活泼的雄性SD大鼠50只,体重220~250g。随机分为5组(n=10),:空白组、假手术组、刺激组、氟桂利嗪组、生理盐水组。空白组为过深麻醉后直接处死;假手术组以台式牙钻颅骨钻洞暴露上矢状窦后,以医用耳脑胶将正负电极固定于其上硬脑膜,但不予电刺激;刺激组以100V,250μs,1.5mA,频率3Hz,方波电流刺激2h;氟桂利嗪组和生理盐水组分别以1mg/kg标准给予氟桂利嗪悬浊液和生理盐水腹腔注射,10天后实施手术,给予电刺激。所有实验动物均由解放军总医院实验动物中心提供。2.电钻开孔制患者实验动物以10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔内注射给药麻醉后,固定于立体定位仪上。头正中部剪掉毛发,皮肤消毒,逐层切开皮肤、肌肉,暴露颅骨。以颅中线冠状缝交叉点前5mm为前界,交叉点后8mm为后界,用电钻钻开两个相距1cm,直径为3mm的圆洞,暴露上矢状窦,缝合头皮,休息24h后再次将动物麻醉后暴露颅骨,将电极一前一后固定于其上硬脑膜。用液体石蜡浸过的纱布覆盖颅顶,以防失水。应用日本光电工业株式会社生产的刺激器(型号:SEN27103)和隔离器(型号:SS2102J),以单刺激为电压100V,脉宽250μs,电流1.5mA的方波刺激2h,频率为3Hz。刺激结束1h后灌注固定。以上所有操作均在无菌条件下进行,整个操作过程保持轻柔、安静,避免强光,室温保持25℃左右。3.免疫组化染色假手术组和刺激组在灌注时间上(分组时间2h+1h)保持一致。动物经深麻醉后,首先经升主动脉灌注0.9%生理盐水500ml,继而4℃4%的多聚甲醛磷酸缓冲液快速灌注200ml,慢速灌注300ml。迅速取出脑置于4%的多聚甲醛磷酸缓冲液中后固定12h,移入30%的蔗糖溶液浸泡24h。于冰冻切片机由内耳线0.20mm切至4.20mm,切片厚度25μm,每5张取1张,共32张;行切片免疫组化染色,试剂由SantaCruz公司提供。切片经冷风吹干后,置于4℃丙酮中固定15min后,置于0.01MPBS(pH7.4)漂洗5min后,置于0.3%H2O2甲醇中孵育10min,PBS洗5min×3。然后在正常羊血清中封闭20min。其后直接加入1:100的羊抗兔NF-κB抗体,4℃湿盒中孵育24h。PBS洗5min×3,生物素标记二抗37℃下孵育30min。PBS洗5min×3,辣根过氧化酶标记的链霉卵白素37℃下孵育30min。PBS洗5min×3后,于二氨基联苯胺(DAB)中开始呈色反应。边反应边于镜下观察,约5min可见免疫反应阳性细胞呈紫红色或棕色,以蒸馏水终止反应。将切片脱水透明、封片、观察。4.核浆共染细胞的结构在光学显微镜下NF-κB染色阳性细胞可以呈现核染、浆染和核浆共染3种形式。随着染色程度的不同呈现紫红色或棕色。核染的细胞呈圆形、卵圆形。核浆共染细胞在圆形、卵圆形外观的基础上可见放射样突起,这些突起数量不多,长短不一,为神经元突触。浆染细胞与核浆共染细胞外观相似,但核的区域可见类圆形透光区。以上细胞均很容易与背景区分。于10倍物镜下记录每张切片的NF-κB阳性细胞数,每组切片的NF-κB阳性细胞数据用平均值±标准差表示,组间比较应用Stata软件行单因素方差分析。动物nf-b阳性细胞数检测中脑导水管周围灰质为围绕在中脑导水管周围的区域,分为背中间区,背外侧区,腹外侧区和腹中间区。镜下可见背景为淡黄色。空白组NF-κB阳性细胞数目相对较少;假手术组NF-κB阳性细胞数目相对较少;刺激组NF-κB阳性细胞数明显增多(见图1);刺激+氟桂利嗪组NF-κB阳性细胞数较刺激组明显减少(见图2);刺激+生理盐水组NF-κB阳性细胞数较刺激组没有显著变化(见图3)。于10倍物镜下记录每张切片的NF-κB阳性细胞数,每组动物平均每张切片的NF-κB阳性细胞数用平均值±标准差表示,空白组、假手术组、刺激组、刺激+氟桂利嗪组和刺激+生理盐水组每张切片的NF-κB阳性细胞数分别为111.7±15.7、112.9±10.7、508.7±30.8、209.2±18.5和502.7±33.1。单因素方差分析NF-κB阳性细胞数显示:F值:627.59;刺激组与空白组、假手术组比较阳性细胞数明显增多,差值有统计学意义,P<0.05;刺激+氟桂利嗪组和刺激组比较阳性细胞数明显减少,差值有统计学意义,P<0.05;刺激+生理盐水组和刺激组比较阳性细胞数没有明显差别,差值无统计学意义,P>0.05;空白组和假手术组比较阳性细胞数没有明显差别,差值无统计学意义,P>0.05。氟桂利嗪对模型化大鼠血清nf-b表达的影响NF-κB是许多细胞功能的即早和普遍的转录因子,以p50/p65异二聚体为形式的一种快反应转录因子。NF-κB信号在偏头痛发病机制中起一定作用,在静止的状态下NF-κB转录因子存在于静止的硬脑膜细胞的胞浆里,以抑制蛋白-κB(IκB)作用下的非活性p50/p65二聚体的形式存在。当受到有害刺激时,激活IκB激酶复合物(IKK)使IκB蛋白(NF-κB抑制因子)磷酸化。使NF-κB(p50/p65)自由的进入细胞核,与炎症和应激相关基因(例如iNOS、IL-1β、IL-6和环氧化物酶-2)位点结合而促进复制。导致血管渗透性增加,组织水肿,和疼痛敏感,可以部分的解释在硬脑膜偏头痛发病的分子和功能机制。NF-κB抑制剂作用于NF-κB信号转导通路各环节,以阻断由NF-κB信号转导通路的激活,NF-κB抑制剂的应用可能成为感染、炎症、休克、肿瘤和免疫性疾病治疗的新途径。目前研究发现的NF-κB抑制剂包括:(1)抗炎剂;(2)免疫抑制剂;(3)前列腺素;(4)抗氧化剂;(5)蛋白酶和蛋白酶体抑制剂;(6)一氧化氮;(7)IL-10;(8)微生物产物;(9)合成抑制剂;(10)反义寡核苷酸和圈套寡核苷酸[5~10]。在偏头痛的预防性治疗中,钙通道阻滞剂已经广泛应用于临床。目前已经有大量的研究揭示钙离子与NF-κB的关系。Shen等在严重的半球缺血的大鼠的海马中,发现L型电压门控钙通道介导的NF-κB的激活现象。研究发现L型电压门控钙通道阻滞剂可以增加IκB-a,减少NF-κB转入细胞核表达。研究还发现病理遗传学刺激,包括氧化应激,局部缺血,钙超载,谷氨酸盐毒性和细胞因子均可以激活NF-κB。他们最近的研究发现,谷氨酸盐受体受刺激后能强烈的激活静脉的NF-κB。缺血的神经死亡机制集中于谷氨酸盐受体的激活和其后续的细胞内钙离子的浓缩。一些研究显示NF-κB抑制因子,例如阿司匹林和水杨酸盐,能够保护神经元免受谷氨酸盐诱导的神经元毒性损害。美国研究人员Baltimore等在研究大脑的学习和记忆功能时惊奇地发现,NF-κB在行为学中枢调控过程中亦起重要作用,NF-κB参与行为学中枢调控与钙调节的基因转录有关。钙调节的基因转录是神经元诸多生理功能的重要基础。与学习功能相关的适应性可塑性(adaptiveplasticity)即依赖于此.海马、纹状体、小脑、皮层等脑区神经活动引起的神经元基础突触摄取(basalsynapticinput)可通过钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(Ca2+/calmodulindependentkinaseII,CaMKII)升高钙离子浓度或者直接通过突触膜局部的钙离子浓度升高来激活已选择性存在于突触部位的NF-κB分子P65和P50亚基。激活的NF-κB移入胞核并直接修饰突触信号以调变基因表达。我们的研究设立了钙通道阻滞剂氟桂利嗪组,持续给药达有效血药浓度后,制备电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜的偏头痛模型后灌注取脑,旨在偏头痛模型大鼠的PAG区观察NF-κB表达变化,明确在偏头痛发病过程中钙通道阻滞剂与NF-κB蛋白表达的关系。综上我们利用目前世界上常用的电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜引发硬脑膜神经源性炎症,进而模拟偏头痛发作的实验动物模型,以中脑导水管周围灰质尤其是PAG区为观察区域,把NF-κB蛋白为观察指标,把钙通道阻滞剂作为影响因素。研究发现:动物模型模拟的偏头痛