高效液相色谱法测定猪肌肉组织中磺胺胺甲恶唑、磺胺苯二胺类化合物残留量

高效液相色谱法测定猪肌肉组织中磺胺胺甲恶唑、磺胺苯二胺类化合物残留量

有很多种类的药物，其中磺胺类药物可以快速吸收，并可以保存在动物肉、蛋和奶中24小时。20世纪80年代,由于磺胺类药物在畜禽生产中的广泛使用,兽药残留以磺胺最为严重,动物组织又以猪肉中的残留最多,其次为鸡肉和牛肉。磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间均较长,通过任何途径摄入的磺胺类药物都有可能在体内蓄积。体内长期蓄积的磺胺类药物不仅会导致许多细菌对磺胺类药物产生抗药性,它本身的不良反应也给人体带来严重伤害,如:肾脏损害、急性溶血性贫血、造血系统毒性、过敏反应。除以上影响以外,磺胺残留还具有致畸、致癌、致突变作用。为了解动物性食品中兽药残留水平,探讨其污染来源,评价其膳食安全性,因此建立猪肌肉组织中磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉残留量的高效液相色谱(HPLC)测定方法是十分必要的。1材料和方法1.1超声蒸发测定美国Agilent-1100型高效液相色谱仪,旋转蒸发仪、TorboVap蒸发仪、WH-3型漩涡混合仪、CX-300W型超声波清洗器、LG10-2.4A型离心机。1.2标准系列溶液磺胺标准溶液:标准储备液(1000mg/L):磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉各25.0mg(精确至0.1mg),置于4个25ml容量瓶中,加色谱纯甲醇溶解,并稀释至刻度;磺胺标准系列混合溶液:分别吸取适量标准储备液,置于10ml容量瓶中,用色谱纯甲醇定容,标准系列浓度分别为1,10,60,100,200μg/ml。除非另有说明,分析中使用的均为分析纯的试剂。乙腈(Fisher公司,色谱纯)、甲醇(沃凯公司,色谱纯)、正己烷(Fisher公司,农残级)、冰乙酸、正丙醇、无水硫酸钠(105℃烘烤3h后使用)、超纯水。1.3样品前处理1.3.1样品制备除去猪肉中的脂肪组织并将肌肉组织剁碎、匀浆分装于保鲜袋中,置于冷藏室保存。1.3.2乙腈层蒸发取事先分装好的试样(10g),置于100ml三角瓶中,加入5g无水硫酸钠后,再加入35ml乙腈,超声波提取30min后,4000r/min离心5min,乙腈层过无水硫酸钠后,转移至旋转蒸发瓶中。残渣加入25ml乙腈,超声波提取20min后,4000r/min离心5min,合并两次提取液。1.3.3torbovap蒸发将合并后的上清液于40℃旋转蒸发至近干,加入0.2ml正丙醇,蒸发至近干,用4~5ml乙腈洗涤旋转蒸发瓶。于40℃水浴,用TorboVap蒸发仪吹至1ml左右,用乙腈准确定容至1ml。用旋涡式混合器回旋1min,再加入2ml正己烷回旋1min,4000r/min离心5min,弃去正己烷层,乙腈层过0.45μm尼龙滤膜后,以HPLC测定。1.4测量1.4.1流动相、检测波长色谱柱:Diamonsil(钻石)C185μm,200×4.6mm(迪马公司);柱温:35℃;流动相:甲醇、水;梯度洗脱:0~3min,甲醇:水(V:V)=30:70;3~6min,甲醇:水(V:V)=30:70变化为甲醇:水(V:V)=70:30;6~12min,甲醇:水(V:V)=70:30;检测波长:275nm;进样体积:20μl;流速:1μl/min。1.4.2铬测定取经过提取、净化的乙腈20μl进样,以保留时间定性,峰面积定量。2结果与讨论2.1样品预处理方法的探讨2.1.1萃取溶剂的选择根据待测组分的物理化学特性,以及目前文献上报道的提取溶剂,曾采用乙腈、乙酸乙脂、丙酮、二氯甲烷以及混合溶剂乙腈:乙酸乙酯(3:2)、三氯甲烷:丙酮(2:1)、乙腈:三氯甲烷(1:1)提取,乙腈与其它的混合溶剂提取效率没有太大区别,因此将乙腈作为萃取溶剂。2.1.2萃取溶剂的选择从待测组分萃取效果及方法操作简便、环境污染较小的角度考虑,第一次提取按样品(g):乙腈(ml)=2:7比例进行,以后每次加25ml萃取溶剂。结果表明经过两次萃取就已经将待测组分的97%萃取出来,因此采取2次萃取的方法进行。2.1.3样品体积测定各个品种的猪的肌肉组织中都含有一定量的水分,如果水分除得不够完全,在旋转蒸发时不能蒸发到预先设想的体积,对样品的后续处理及准确定容、测定带来很大的麻烦。因此,采用在样品提取时就按样品(g):无水硫酸钠(g)=2:1比例除去水分,在每次萃取完成后,通过一层无水硫酸钠层过滤后除去剩余的水分。这种方法,基本能将大部分的水分除去,对测量结果没有造成影响。2.1.4旋转蒸发时间猪肉组织中含有大量的脂肪,能否将脂肪除去,净化样品,降低杂质对测定的影响,十分重要。由于被测组分的物理化学性质都不溶于正己烷,因此用正己烷除去样品中的脂肪。正己烷的加入时间有在旋转蒸发前和在旋转蒸发后加入两种方式。但如果在旋转蒸发前加入,由于正己烷较轻在上层,对乙腈层的完全转移造成困难,对准确的定量造成一定的影响。而且要想将脂肪净化的完全就必须加大正己烷的使用量,这就增大了对环境的危害。因此,采用在旋转蒸发后加入正己烷除去脂肪的方法,而且在将提取溶液准确定容至1ml后再加入正己烷,这样就不会产生因为正己烷在乙腈的上层而对试验结果造成偏差的影响。2.2流动相的处理由于动物性食品基质复杂,尽管前处理净化步骤已除去很多杂质,仍有一些杂质干扰磺胺类药物的定量,这就需要选择合适流动相来解决。文献报道的测定磺胺类药物的反相HPLC流动相体系主要有:乙酸水溶液+甲醇+乙腈,水溶液+甲醇+乙腈,磷酸盐水溶液+甲醇+乙腈。通过反复对比试验,选择流动相体系为:水+甲醇。该体系能使待测磺胺类药物组分在较短时间内与试样杂质峰分开。在此条件下,能使空白试样的杂质峰与待测磺胺类药物峰在色谱图中达到基线分开(见图1)。2.3方法学参数2.3.1线性范围和检出限以磺胺类药物的峰面积与磺胺类药物浓度计算线性方程,4种磺胺类药物在1~200μg/ml范围内均呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.999。2.3.2lod和loq的计算分别以信噪比为3和10倍确定方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ),以取样10.0g计算,经多次重复试验,确定LOD和LOQ分别为0.01mg/kg和0.05mg/kg。以空白猪的肌肉组织在0.05mg/kg水平加标,结果信噪比均大于10。2.3.3回收率及精密度采用自购猪肌肉组织作为加标试样,经测定磺胺类药物含量均低于检测限。以此10.0g猪肌肉组织在3个加标水平同时添加各磺胺类药物标准并进行6次回收试验,加标水平分别为0.05、0.50和10.00mg/kg,磺胺嘧啶(SD)平均回收率为81.7%~94.1%(n=6,以下同,见表1),磺胺甲恶唑(SMZ)80.0%~94.5%,磺胺对甲氧嘧啶(SMD)为80.7%~102.9%,磺胺喹恶啉(SQX)80.3%~93.6%。待测的磺胺类药物的回收率都在80%~120%之间,符合痕量分析的要求。2.3.4相对标准偏差在加标回收试验中,对3个加标水平各重复测定6次,磺胺嘧啶(SD)相对标准偏差(RSD)为8.11%~4.99%(n=6,以下同,见表1),磺胺甲恶唑(SMZ)相对标准偏差(RSD)为8.37%~3.90%,磺胺对甲氧嘧啶(SMD)相对标准偏差(RSD)为8.06%~5.44%,磺胺喹恶啉(SQX)相对标准偏差(R