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文档简介
猪组织中喹烯酮及其代谢物残留消除规律研究
烯酮(qct)是中国农业科学院兰州兽医与动物育种研究所开发的一种新药物添加剂。它是一种含有糊精素的复合制剂。报告称,该药物具有高度的抗菌作用,对促进山羊的生长起到了明显的作用。在动物体内,它代谢快,没有残留物,没有积聚,具有“三致”的优点。近年来的研究表明,磺酰胺具有潜在的细胞毒性和代因毒性。这种动物体内的代谢过程非常复杂,可能会产生各种代谢产物。为了更好地评估棕榈醇在动物体内的安全性,本试验研究了磺醇及其主要代谢物在猪组织中的残留规律,为确定磺醇在动物可食组织中的残余和休闲时间的基本数据提供了基础数据。1材料和方法1.1qct-n4-一氧化物和龙头合成的羟基化合物Agilent1200型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;API4000电喷雾-串联四级杆质谱仪,美国应用生物系统公司.喹烯酮标准品(w=90%)为Sigma公司产品,喹烯酮原料药(QCT,w=98%)由华中农业大学提供,3-甲基-苯乙烯酮-喹恶啉(Q4,w=95%)、3-甲基-苯乙烯酮-喹恶啉-N4-一氧化物(Q2,w=95%)和3-甲基-2-羧酸-喹恶啉(Q31,w=97%)由中国农业大学合成.1.2动物的饲养与测定40头去势的三元杂交猪(以杜洛克为父本,长白、大白杂交一代为母本),体质量(50.0±5.3)kg,购于广州力智农业有限公司.每天饲喂空白饲料并让其自由饮水,饲养2周后猪只表现健康,将其随机平均分成8组.按照体质量20mg·kg-1剂量,在每天8:00和18:00内服给药,连续5d,最后一次给药后4、6、12、24、72、120、168、216h各宰杀1组,采集动物的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪.1.3u3000培养条件称取2g均质过的组织,加5mL乙酸乙酯,振荡10min,8000r/min离心10min,取上清液移入15mL离心管中,残渣用5mL乙酸乙酯重提1次,在氮气流下吹干;加5mL0.3mol·L-1HCl溶液溶解残渣,再用10mL乙酸乙酯分2次从HCl溶液中萃取药物,将上清液全部转移至前面吹干的15mL离心管中,再次用N2吹干.用6mL体积分数为16.7%甲醇水溶液溶解残渣,过HLB固相萃取小柱,用1mL体积比2∶98的甲酸-乙腈溶液洗脱,取10μL上样.1.4液体层析成像和质量分析的条件1.4.1u3000酸、质、水、质色谱柱:phenomenexC18柱(150mm×2mm,粒径5μm);柱温:30℃;流动相A:体积分数0.1%甲酸水溶液,流动相B:乙腈;流速0.25mL/min,进样量10.0μL.QCT、Q2、Q4的梯度洗脱条件:0~1min,90%A~40%A;1~7min,40%A~20%A;7.0~7.1min,20%A~90%A;7.1~13.0min,90%A.Q31的梯度洗脱条件:0~1.5min,2%A~70%A;6.0~6.1min,70%A~2%A;6.1~12.0min,2%A.1.4.2定量离子对QCT、Q2、Q4采用电喷雾正离子模式扫描,多反应监测方式(MRM),QCT的母离子为307.1(m/z),子离子为273.1(m/z)、131.1(m/z),307.1/131.1(m/z)为定量离子对;Q2的母离子为291.1(m/z),子离子为159.0(m/z)、245.2(m/z),291.1/159.0(m/z)为定量离子对;Q4的母离子为275.2(m/z),子离子为143.1(m/z)、247.2(m/z),275.2/247.2(m/z)为定量离子对;Q31采用电喷雾负离子模式扫描,多反应监测方式,母离子为187.1(m/z),子离子为142.9(m/z)、101.9(m/z),其中187.1/142.9(m/z)为定量离子对.1.5组织药动学参数给药后不同时间点组织样品,按“1.3”方法处理后做LC-MS/MS分析,记录QCT,Q2,Q4的峰面积,计算组织中药物浓度.根据药物浓度-时间数据,采用WinNonLin6.1软件进行非房室模型计算,分别求出组织药动学参数.2试验结果2.1空白组织样品、空白添加样品、给药后4h组织样品的制备QCT、Q2、Q4及Q31的出峰时间分别为6.97、8.25、9.65、8.98min,相互之间无干扰(图1).空白组织样品、空白添加样品、给药后4h组织样品的色谱如图2所示.2.2标准曲线的建立取一系列标准混合溶液,在“1.4”条件下检测药物含量,做出标准曲线.QCT、Q2、Q4在2~200ng·g-1范围内线性关系良好.用直线回归法对数据进行分析处理,以一定标准品溶液的质量比作为横坐标,相应的峰面积作为纵坐标,QCT的标准曲线方程:y=803.31x+1879.7,r2=0.9955;Q2的标准曲线方程:y=2268.6x+348.44,r2=0.9997;Q4的标准曲线:y=4297.7x-1168.8,r2=0.9996;Q31的标准曲线:y=4009x-605.07,r2=0.9993.药物的检测限(3S/N)为2ng·g-1,定量限(10S/N)为4ng·g-1.2.3前处理方法回收率在2g空白组织中加入100μL不同质量比的标准混合溶液,使终质量比为5、50和200ng·g-1,前处理操作步骤同“1.3”,每批5个重复,做5个批次.QCT、Q2和Q4在各类样品中的方法回收率70%~100%,批内和批间变异系数均小于10%,可满足测定的需求.2.4单次给药后肝脏中4种常用药物的残留猪只按体质量20mg·kg-1多剂量口服给药后,QCT、Q2、Q4在肌肉,肾脏,肝脏,脂肪中不同时间点的药物质量比实测值见表1.Q31仅在肾脏中检测到,6h达到最高质量比,为(8.47±3.85)ng·g-1,24h已经检测不到.从表1可见,给药后肝脏中Q4的残留量最多,最高质量比为(474.73±58.62)ng·g-1,脂肪的残留量最少,肌肉中的药物残留时间最长;而4种药物中Q4的残留量最多,Q31的残留量最少,QCT的残留时间相对较长一些.2.5种组织中消除不同期次的qct药时曲线比较采用WinNonLin6.1软件进行非房室模型计算,所得药物在各组织中的药动学参数见表2.由表2可见,肝脏中Q4药时曲线下面积及肌肉中QCT药时曲线下面积相对较大,分别为9036.43和7561.14μg·kg-1·h,4种组织中消除半衰期均以肌肉中为最长,QCT、Q2、Q4在肌肉的消除半衰期分别为33.53、39.50、26.13h.3qct残留靶组织的确定喹烯酮及其3种主要代谢产物结构不同,极性大小也有较大差异,尤其是Q31必须在酸性条件下才能提取出来,而且动物可食组织中含量很小,这就要求建立的方法必须灵敏度高、检测限低、重复性好.本测定方法的关键是如何从组织中将4种药物全部提取出来同时与杂质分离.本研究过程中利用QCT、Q2、Q4、Q31这4种药物的酯水分配系数的特性,以乙酸乙酯提取后选用HLB固相萃取小柱净化样品,既保证了稳定的药物回收率又减少了杂质的干扰.喹烯酮是我国自主研制的一类新兽药,目前尚未完全确定该药的残留标示物,但初步认为Q2、Q4、Q31是QCT重要的代谢物.李剑勇等初步将喹烯酮原形药做为残留标示物,随后又通过HPLC测定尿液中的代谢产物,认为3-甲基-喹恶啉-2-羧酸是残留标示物,但是刘兆颖采用体外肝代谢系统在肝微粒体中发现25种代谢产物,但是没有Q31.本试验条件下,仅在肾脏中发现很低浓度的Q31,这与刘兆颖所说的代谢物Q31可能不在肝微粒体中产生相吻合.据估计,产生Q31的代谢酶可能在肾脏中,也可能是肝脏、肾脏等几种组织几种酶共同作用的结果,这个问题还有待进一步的研究.李剑勇等曾在喹烯酮残留消除研究中以肝组织为靶组织,喹烯酮原形药为残留标示物,认为喹烯酮在猪使用上无需休药期.本研究中猪只按体质量20mg·kg-1多剂量给药后,Q4的含量相对较高,给药后6h,在肝脏中达到
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