火力发电过程中游离脂肪酸、硫代巴特妥酸的分析

火力发电过程中游离脂肪酸、硫代巴特妥酸的分析

脂质分解氧化是干腌制足部的主要生物化学过程。其分解产物游离脂肪酸（ffa）是腿肉动物的前体，对干腌制足部的味道物质的产生有特殊贡献。脂质分解氧化受加工过程中温度、湿度、盐分等条件的影响。早期对干腌火腿脂质氧化分解的研究是针对股二头肌和半质膜肌内脂肪的,如Antequera等通过分析测定Iberian火腿加工过程的肌内FFA过氧化值(POV)及挥发性化合物来研究肌内脂质分解氧化及对火腿风味的贡献;Motilva等通过分析测定Serrano火腿加工过程中股二头肌中的非挥发性FA、短链FA以及脂酶和酯酶活性研究确定加工过程的脂质分解现象;Coutron-Gambotti等研究了法国Corsican火腿的皮下脂肪组织的脂质分解和氧化过程,确定了不同工艺阶段脂质和FFA构成变化及脂质氧化方式;Vestergaard等研究了Parma火腿的肌内脂肪分解活力(酸性和中性脂酶活性)、FFA以及水分活度、湿度、氯化钠含量和加工时间对肌间脂酶活性和FFA的影响。金华火腿是中华民族最具地方传统特色的干腌火腿,以其色香味俱全著称于世,对Parma火腿等欧洲传统肉制品加工技术产生过重大影响,但对金华火腿加工过程中脂质分解氧化的研究才刚刚起步,仅见Du等分析测定了金华火腿产品中的总脂和FFA。本研究试图通过对加工过程中金华火腿FFA、TBARS及双烯值和羰基值等的分析,研究其加工过程中脂质分解氧化规律及与温度条件的相关性,旨在为金华火腿加工工艺现代化提供理论参考。1材料和方法1.1试验材料1.1.1发酵、成熟按照传统“低温腌制脱水、中温发酵、高温成熟”工艺实施:原料腿在冬季(温度5～12℃,相对湿度(83±8)%)腌制35d,室外洗晒15d(温度6～13℃,相对湿度(80±15)%),然后进入发酵成熟室上架,经过春夏两季6个多月的低温(10～15℃)脱水、中温(15～30℃)发酵、高温(30～37℃)成熟3个阶段,于8月中旬成熟下架。1.1.2试验材料的制备分别取金华火腿原料以及腌制结束、晒后上架、发酵中期、高温成熟中期、成熟下架6个工艺点的股二头肌中间部分作试验材料。每个工艺点抽取5条火腿,采样,现场切块包装,在-20℃条件下贮存备用。样品由浙江省食品有限公司兰溪永鑫火腿厂提供。1.1.3氟化硼-甲醇法氯仿甲醇混合液(V/V=2∶1),氯仿异丙醇混合液(V/V=2∶1),2%(W/W)乙酸-乙醚溶液,7.3mg·L-1NaCl和0.4mg·L-1CaCl2混合液,10%(W/W)三氟化硼-甲醇。肉豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)、花生酸(C20∶0)、花生四稀酸(C20∶4)及其甲酯标准样品均购自Sigma公司。1.1.4uv-2501分光光度计64R型冷冻高速离心机(美国BECKMANCOULTER公司);岛津UV-1601分光光度计(Shimadzu);岛津GC-14B气相色谱(Shimadzu)。1.2测试方法1.2.1蛋白与液质v的提取根据Folch等的方法:取5.0g股二头肌切碎,称取2.0g于离心管,加15mL氯仿甲醇混合液,匀浆60s,移到带塞量筒中定容至40mL,静置30min,过滤除去蛋白、结缔组织,加0.22倍体积的7.3mg·L-1NaCl和0.4mg·L-1CaCl2混合液(使V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=8∶4∶3,有利于提取脂质),静置2h或3000r·min-1离心15min,吸净上层液体(水、甲醇、离子等杂质),剩余液体用SENCOR-201旋转蒸发器40℃水浴真空蒸干,-20℃条件贮存备用。1.2.2脂肪酸的提取按照García等的方法称取10mg脂质,用氯仿溶解,吸取一定体积(约含10mg脂质)上柱(BondElutLrc-NH2100mg,DIKMA)分离,先用氯仿异丙醇混合液2mL洗出中性脂质,再用2%乙酸-乙醚溶液3mL洗出游离脂肪酸。1.2.3,2-二甲氧基丙烷的制备先将洗出的游离脂肪酸用氮吹仪挥干溶剂,然后加2mL10%三氟化硼-甲醇,再加几滴水清除剂(2,2-二甲氧基丙烷)促进甲酯化反应向右进行;60℃水浴30min,冷却后加1mL水和1mL正己烷振荡3min,静置分层,完全吸取上层有机层,再加入十七酸甲酯(100μg·mL-1正己烷)作内标,用氮吹仪挥干溶剂后用正己烷定容至0.4mL或0.8mL,以备气谱测定。1.2.4火焰离子检测CP-Sil88柱(50m×0.25mm×0.20μm,Fame公司);载气(99.9999%N2)压力为60kPa,进样口温度280℃,火焰离子检测器(flameionizationdetector,FID)检测温度为280℃。升温程序:160～220℃,6℃·min-1。进样量1.5μL,分流比1∶40。1.2.5tba含量测定根据Klein的方法:取200μg脂质溶于1mL环已烷,测定232、215和275nm处的吸光值,A232/A215定义为双烯值,A275/A215定义为羰基值。TBA试验按照Salih等的程序测定:取中间部分的股二头肌5g切碎,于离心管加25mL20%TCA和20mLH2O,匀浆60s,静置1h,2000g离心10min,过滤,用双蒸水定容到50mL,然后取2mL滤液加2mLTBA(0.02mol·L-1)在沸水浴中反应20min,取出用流动水冷却5min,然后用岛津UV-1601分光光度计测定532nm处的吸光值。空白样:25mL20%TCA用双蒸水定容到50mL,然后取2mL滤液加2mLTBA。1.3标准曲线的构建和数据处理1.3.1ffa标准曲线方程参考García等的方法,根据文献报道和晒后及成品火腿脂肪中FFA含量的预测结果,确定各种游离脂肪酸的最高含量,按此最高含量把脂肪酸标样混合,用正己烷配制定容为10mL,再按0.7倍稀释成5点标样梯度,各吸取1.00mL进行甲酯化处理,十七酸甲酯(100μg·mL-1正己烷)作内标进行GC分析测定,以各标样脂肪酸甲酯与内标峰面积的比值为横坐标,标样梯度为纵坐标,建立FFA标准曲线方程(表1)。1.3.2游离脂肪酸测定将脂肪酸甲酯峰面积与内标十七酸甲酯峰面积的比值代入标准曲线方程,即可计算出各种游离脂肪酸的含量。数据用MicrosoftExcel统计处理,用SAS7.0软件分析差异显著性。2结果与分析2.1ffa主体的脂肪酸从表2可知,火腿中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸是FFA的主体成分,在原料中占92.20%,在成熟结束时占93.58%,多不饱和脂肪酸以亚油酸为主。2.1.1ffa的缺失造成的盐灰热从表2可见,各种FFA在加工过程中均先降低再增加,分别在腌制结束或晒后达到最低,这是由于腌制脱水作用使部分FFA随火腿中水分的流失而散失,这期间的平均温度为8.6℃左右,脂质分解处于最低水平,使各种FFA含量在盐后或晒后降到最低;中温发酵过程由于温度升高而加快脂质分解,各种FFA含量显著增加,其总量在发酵中期达到最高点。2.1.2ffa的表达高温成熟阶段饱和脂肪酸C14∶0、C16∶0、C18∶0缓慢增加,单不饱和脂肪酸C16∶1、C18∶1增加显著(P<0.05),多不饱和脂肪酸C18∶2、C20∶4显著降低(P<0.05),FFA总量基本保持稳定且略有降低(表3)。发酵成熟过程中脂质分解与氧化同时发生,发酵中期强烈的脂质分解加剧了脂质氧化,不饱和脂肪酸易氧化,多不饱和脂肪酸比单不饱和脂肪酸更易氧化,而温度的升高使火腿中水分含量显著降低(P<0.05),氯化钠含量显著升高(P<0.05),高盐会抑制脂肪分解酶活性,使脂质分解速度小于氧化速度,结果使FFA总量在高温成熟过程略有降低。2.2在传统的加工过程中，脂质氧化及其相关分析进行了相关性分析2.2.1低温和发酵中期tbaTBARS是以多不饱和脂肪酸氧化产物丙二醛为主体的醛类物质与TBA反应在532nm的吸光值,从表3和表2可知:原料经过一个月的腌制,TBARS显著提高,而多不饱和脂肪酸C18∶2、C18∶3、C20∶4含量显著降低,说明以多不饱和脂肪酸氧化产物丙二醛为主的醛类物质在低温条件下也大量增加;发酵中期TBARS略有降低,说明醛类物质随着温度的提高进一步氧化成有机醇和羧酸;高温成熟过程TBARS显著降低,说明这种连续的氧化反应更加剧烈。相关分析结果表明TBARS与温度呈显著负相关(R2=0.8340)。2.2.2键的几何?双烯值反映不饱和脂肪酸氧化初始形成的共轭双键的多少。表3显示,双烯值在腌制过程中因水分流失略有降低,晒后和进入高温成熟有显著提高,与温度呈正相关(R2=0.9388)。2.2.3发酵成熟过程随发酵温度的变化羰基值反映脂肪酸氧化分解产物醛和酮的多少。由表3可见,加工过程中羰基值与温度呈显著正相关(R2=0.8416),在发酵成熟过程随着温度的提高而显著增加(P<0.05)。醛和酮等羰基类化合物是干腌火腿中一类主要的挥发性风味物质,羰基值在发酵成熟过程中的显著增加也从一个方面反映出金华火腿挥发性风味物质在高温成熟过程中的变化规律。3热成熟过程与肉品质的变化脂质分解受温度的影响较大。表2显示:低温腌制脱水阶段各种FFA无显著增加,而进入中温发酵过程有极显著增加(P<0.01),这与脂肪中甘油三酯在不同温度下的物理特性有关。包含2个饱和脂肪酸的三酰基甘油酯(PSO、PPO)在14～18℃时是固态,大大限制了脂酶的水解活性,超过18℃时是液态,大大提高了脂酶在油-水界面上的水解活性。本研究中温发酵过程由于温度的升高加快脂质分解,各种不饱和脂肪酸的氧化速度也有显著提高。由于高温成熟阶段各种脂酶活性显著降低,结果使FFA总量在高温成熟过程略有降低。高温成熟是传统金华火腿有别于地中海地区国家干腌火腿的工艺特色,其成熟温度比西班牙Serrano火腿高10～12℃,比Iberian火腿高7～10℃,比Parma火腿高15～20℃。金华火腿高达30～37℃的成熟高温使多不饱和脂肪酸氧化反应更加剧烈,结果使高温成熟后期TBARS和羰基值显著提高(P<0.05),亚油酸和花生四稀酸含量极显著降低(P<0.01),火腿中FFA总量表现出与地中海地区火腿不同的变化趋势。火腿风味物质产生与脂质氧化开始是一致