第三章 质谱法

第三章质谱法1第1页，课件共79页，创作于2023年2月质谱用途一、研究有机物离子裂解机理；

1956年，麦式重排。二、测定有机物分子量三、运用质谱推导有机分子结构。 例如1963年利用质谱配合红外光谱就测定了生物碱白坚木瑞素的结构。第2页，课件共79页，创作于2023年2月MassSpectrometersProtectSoldiersinIraq

MassspectrometersactassensitivechemicalwarfaredetectorstoprotecttroopsinwaronIraq.第3页，课件共79页，创作于2023年2月第4页，课件共79页，创作于2023年2月生物质谱蛋白质分子质量的测定；氨基酸序列分析；蛋白质的质量肽谱；蛋白质突变体分析以及蛋白质翻译后修饰的测定；配位体结合的研究；酶的活性部位研究和蛋白质折叠和高级结构的研究；核酸片段分子质量的测定；寡核苷酸序列分析；核酸修饰部位的鉴定；多糖和寡糖的结构分析。第5页，课件共79页，创作于2023年2月APPLICATION第6页，课件共79页，创作于2023年2月质谱发展历史1897年，英国剑桥Cavendish实验室的Thomson研制，发现了氖的同位素，分辨率10。1919年，Aston,速度聚焦质谱仪，测出氖同位素的丰度比为10：1，分辨率130。1934年，双聚焦质谱仪，大大提高了分辨率。二战期间，用于美国原子弹制造计划（研究235U）。1943年，进入民用，石油分析。50年代，出现新型质量分析器，四极滤质器（1953），脉冲飞行时间分析器（1955），及新的离子化手段，火花离子源、二次离子源，气质联用。60年代以后，新的离子化方法：FI，FD，CI，激光离子化，ICP，FAB，ESI，复杂的质谱仪推出，离子探针，三级四极杆，四极杆飞行时间，磁场四极，磁场飞行时间，离子回旋共振等，液质联用。1974年等离子体质谱，1981年快原子轰击质谱，1988年，电喷雾电离质谱，90年代以后，EPI-MS，MALDI-MS用于生物间非共价键作用研究，联用技术发展迅速。第7页，课件共79页，创作于2023年2月第8页，课件共79页，创作于2023年2月日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山县首府富山市，1983年获日本东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰·芬恩，因此也得到了1／4的奖金。美国科学家约翰·芬恩1917年出生于美国纽约市，1940年获耶鲁大学化学博士学位，1967年到1987年间任该大学教授，1987年起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分析法”而获得今年诺贝尔化学奖1／4的奖金。瑞士科学家库尔特·维特里希1938年生于瑞士阿尔贝格，1964年获瑞士巴塞尔大学无机化学博士学位，从1980年起担任瑞士苏黎世联邦高等理工学校的分子生物物理学教授，还任美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所客座教授。他因“发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”而获得2002年诺贝尔化学奖一半的奖金。2002年诺贝尔化学奖获得者第9页，课件共79页，创作于2023年2月一、质谱分析原理二、仪器与结构三、联用仪器

第一节基本原理与质谱仪第10页，课件共79页，创作于2023年2月进样系统离子源质量分析器检测器1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光

1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆

质谱仪需要在高真空下工作：离子源（10-310-5Pa

）

质量分析器（10-6Pa

）1．大量氧会烧坏离子源的灯丝；2．用作加速离子的几千伏高压会引起放电；3．引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。一、质谱分析原理第11页，课件共79页，创作于2023年2月质谱仪第12页，课件共79页，创作于2023年2月电离室原理与结构仪器原理图原理与结构第13页，课件共79页，创作于2023年2月在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行；

离心力=向心力；m

2/R=H0eV曲率半径：

R=（m

）/eH0

质谱方程式：m/e=(H02R2)/2V离子在磁场中的轨道半径R取决于：m/e、H0、V改变加速电压V,可以使不同m/e

的离子进入检测器。质谱分辨率=M/M

（分辨率与选定分子质量有关）加速后离子的动能:(1/2)m

2=eV

=[(2V)/(m/e)]1/2质量分析器原理第14页，课件共79页，创作于2023年2月二、仪器与结构第15页，课件共79页，创作于2023年2月FTICRMSWithESIAndMALDI第16页，课件共79页，创作于2023年2月仪器内部结构三、联用仪器第17页，课件共79页，创作于2023年2月联用仪器（THEGC/MSPROCESS）SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD第18页，课件共79页，创作于2023年2月

1．样品的离子化；2．离子的分析检测（分离管）；3．信号记录、数据采集与处理。

质谱过程

一．质谱仪 进样系流、离子源、加速电场、离子分析器、检测器。第19页，课件共79页，创作于2023年2月 一）进样系统 1：直接进样杆（DIP)： 2：加热贮槽进样器： 3：联用技术进样：GC-MS、LC-MS。进样系统第20页，课件共79页，创作于2023年2月第21页，课件共79页，创作于2023年2月根据样品性质、状况，如挥发性、极性、纯度等进行选择，才能取得良好结果。1、固体和大多数液体的纯有机化合物，先用易挥发的溶剂配成溶液，置入特制的样品杯，由样品杆（探针杆）送入预真空室，抽除溶剂后再送入离子源。进入离子源的样品，通常可被样品杆上的特殊装置加热、汽化后再进入离子化室。2、对于气体及沸点不高的易于挥发的液体，一般将贮样器抽成真空，并加热至150℃。样品用微量注射器注入，气化后压入离子源中。3、对于混合物组成的样品，一般可利用与质谱联机的气相色谱或高压液相色谱仪分离成单组分，然后，各个组分逐个地通过特殊的联机接口，进入离子源，进行各纯组分的质谱测定。第22页，课件共79页，创作于2023年2月1．电子轰击离子源 （electionimpact，EI）

使具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离。（一般为70ev）

二）离子源第23页，课件共79页，创作于2023年2月EI第24页，课件共79页，创作于2023年2月第25页，课件共79页，创作于2023年2月第26页，课件共79页，创作于2023年2月第27页，课件共79页，创作于2023年2月第28页，课件共79页，创作于2023年2月第29页，课件共79页，创作于2023年2月 EI优点：结构简单，稳定，质谱图再现性好，易于操作。电离效率高。

EI缺点：分子离子峰太弱；并且有些分子本身由于分子量太大或极性太强，无法顺利气化。所以要用软电离方法。第30页，课件共79页，创作于2023年2月 2．化学电离离子源 (chemicalionization，CI) CI适用于能够进入气相，但分子离子峰很弱的化合物，例如长链胺、脂、醇等。

CI第31页，课件共79页，创作于2023年2月第32页，课件共79页，创作于2023年2月例:CH4＞第33页，课件共79页，创作于2023年2月生成的CH5+、C2H5+活性离子再与样品分子M发生质子转移反应：第34页，课件共79页，创作于2023年2月上述生成的（MH）＋、（M-H）＋也可写成（M＋1）＋和（M一1）＋。因此，采用化学电离法生成的分子离子峰不是M峰，而是(M+1)峰和(M-1)峰，且相对丰度很大，在确定分子量时要注意这一点。第35页，课件共79页，创作于2023年2月化学电离法的优点即使对于不稳定的有机化合物，也可得到相对丰度较大的分子离子峰，有利于分子量的测定。化学电离法缺点碎片离子峰较少，可提供的有关结构方面的信息少。现在多将化学电离法和电子轰击法配合使用，这样可互相取长补短。除CH4外，化学电离法常用的反应气体还有H2,N2,C3H8等。第36页，课件共79页，创作于2023年2月CI和EI比较CI和EI不同，样品分子不是与电子碰撞，而是与试剂离子碰撞而离子化的，如果用烷烃作试剂气，CI通常产生质子化的样品分子。质子化的部位通常是具较大的质子亲和力的杂原子。质子化的分子也可能裂解，丢失包括杂原子的碎片。由于C-C键断裂的可能性在CI中较少，CI中碎片离子较少。CI和EI是相互补充的。第37页，课件共79页，创作于2023年2月 3．场致电离(fieldionization,FI)和场解吸(fielddesorption,FD)

场致电离中，金属阳极和阴极之间的距离很近，通常小于lmm。在这两极之间施加几千伏甚至上万伏稳定直流电压，于是在阳极的尖端（其曲率半径约为2.5mm)附近可产生强度约为107V/cm的强电场，该强电场可以把尖端附近不到lmm处的样品分子中的电子拉走，形成分子离子。然后和其它离解方法一样，把正离子引出加速，并聚焦成离子束。FI,FD第38页，课件共79页，创作于2023年2月场解吸电离法的原理类似于场致电离法，但在样品引入方式上有所不同。将用作场离子发射体的细丝（一般是经过活化的钨丝）放在样品溶液中浸一下，少量样品就沾在上面。待溶剂挥发后样品分子就吸附在发射体上，在细丝上通以电流使样品解吸，并扩散到高场强的场发射区域进行电离。与固体的气化能相比，解吸能要小得多。所以场解吸电离法是一种温和的电离方法。它产生的分子离子峰的相对丰度比场致电离法产生的还要大。第39页，课件共79页，创作于2023年2月下图是氯霉素分别通过电子轰击法、场致电离法和场解吸电离法得到的质谱。采用电子轰击法，氯霉素得不到分子离子峰，它极易裂解为m/z=170,152的碎片离子。采用场致电离法可得到相对丰度约为6％的分子离子峰,m/z=322，采用场解吸电离法测得的分子离子峰，其相对丰度约为26％。第40页，课件共79页，创作于2023年2月第41页，课件共79页，创作于2023年2月FD优点：特别适合于对难气化和热稳定性差的样品作定性鉴定和结构测定。如肽类化合物、糖、有机酸的盐、有机金属化合物等。

FD缺点：峰比较少；测定技术难度较大，重现性不太理想。第42页，课件共79页，创作于2023年2月 4．快原子轰击 （fastatombombardment,FAB） FAB的具体做法是将试样分散于一种底物中，将试样溶液涂布在一个金属靶上，用数千ev的惰性气体粒子对准靶心攻击。这时，原来的离子，都被“溅射”而进入气相，并被导入偏转区而被测量。

FAB第43页，课件共79页，创作于2023年2月第44页，课件共79页，创作于2023年2月FAB适用于挥发性极低、强极性或离子型的化合物；或对热敏感、分子量较大的极性有机分子。但是FAB质谱通常没有分子离子峰，分子量信息来源于加成离子（MH+等）。加成离子常脱水生成强峰，所以确定未知物的分子量并非是轻而易举的。第45页，课件共79页，创作于2023年2月 5．基质辅助激光解吸质谱（matrix-assistedlaserdesorption-ionization,MALDI）

MALDI第46页，课件共79页，创作于2023年2月第47页，课件共79页，创作于2023年2月第48页，课件共79页，创作于2023年2月优点：

a.使一些难于电离的样品电离，且无明显的碎裂，得到完整的被分析物的分子的电离产物，特别是在生物大分子：肽类化合物、核酸等取得很大成功。b.由于应用的是脉冲式激光，特别适合于与飞行时间质谱计相配，因而常见MALDI-TOFMS这个术语。第49页，课件共79页，创作于2023年2月

6．大气压电离（atomsphericpressureionization,API） API主要应用于LC-MS联用。它包括电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）。第50页，课件共79页，创作于2023年2月ESI第51页，课件共79页，创作于2023年2月第52页，课件共79页，创作于2023年2月APCI第53页，课件共79页，创作于2023年2月 三）离子分析器（质量分析器） 质量分析器的作用是将离子源中形成的离子按质荷比值的大小不同分开。离子分析器第54页，课件共79页，创作于2023年2月

1．单聚焦质谱计 a．分辨率较低，其分辨率小于1000，只能分辨单位质量b．扫描速度不高。

第55页，课件共79页，创作于2023年2月单聚焦质谱仪是一种低分辨率的仪器。其分辨率小于1000，只能分辨单位质量。有机质谱法常常要求得到高分辨率的质谱数据及准确的质量测定结果，即要求仪器能分辨名义质量相同而准质量不同的离子并给出具6位有效数字的质量测定结果。这需要性能更好的仪器。第56页，课件共79页，创作于2023年2月第57页，课件共79页，创作于2023年2月正离子从电场中获得的势能zE应等于其受到加速后的动能1/2mv2。zE=1/2·mv2式中z——正离子电荷，库伦（coulunmbs）；

E——高电场电势；

m——正离子质量；

v——正离子速度。第58页，课件共79页，创作于2023年2月正离子经加速后，进入一磁场，并在磁场力FH的作用下沿曲率半径为R的圆周作圆运动。此时，磁场力FH=向心力Fc已知磁场力FH=Hzv（式中H为磁场强度）而向心力Fc=mv2/R（式中R为曲率半径）故Hzv=mv2/Rv=HzR/m（质谱基本方程）第59页，课件共79页，创作于2023年2月代入式zE=1/2·mv2得m/z=H2·R2/2E式中的m/z称为离子的质荷比(masstochargeratio）。从中可以看到，正离子在磁场中的运动轨迹取决于E,H和M/Z，若E,H一定，则正离子的轨道半径R只与它的质荷比有关。第60页，课件共79页，创作于2023年2月第61页，课件共79页，创作于2023年2月2．双聚焦质谱计 在磁分析器前（后）加一扇形电场（能量分析器）。是一个速度分离器,起到能量色散作用或称能量过滤作用。从而实现方向和能量双聚焦。提高了分辨率。第62页，课件共79页，创作于2023年2月第63页，课件共79页，创作于2023年2月

3．

飞行时间质谱计 （timeofflight,TOF-MS）

TOF第64页，课件共79页，创作于2023年2月 a.

检测离子的质荷比没有上限，这特别适合于生物大分子的测定。 b.

由于要求两种尽可能同时飞行，也就特别适合于与脉冲产生离子的电离过程相搭配，例MALDI-TOF。 c.

灵敏度高。d.

扫描速度快，适于研究极快的过程。e.

结构简单，便于维护。 缺点：分辨率随质荷比的增加而降低。第65页，课件共79页，创作于2023年2月第66页，课件共79页，创作于2023年2月第67页，课件共79页，创作于2023年2月MALDI

-TOF第68页，课件共79页，创作于2023年2月QuadrupoleMS第69页，课件共79页，创作于2023年2月

四极质量分析器和扇形磁场的质量分析器在原理上是截然不同的。后者靠离子动量的差别把不同质荷比的离子分开；而四极质量分析器则