基于红外光谱和磁共振波谱的漆酶天然介体体系处理木素结构研究

基于红外光谱和磁共振波谱的漆酶天然介体体系处理木素结构研究

油漆是一种双醇氧化机制。在介质和氧气的作用下，纸浆中的残余木材可以氧化分解。具体反应机制如图1所示。但常用的介体主要是合成介体如HBT、ABTS等具有价格高和潜在的毒性等特点,限制了漆酶体系的工业化应用。因此,寻找可替代合成介体的高效、廉价、环保、可再生的天然介体的来源是LMS漂白技术工业化应用的关键。Camarero等用以紫丁香醛、乙酰丁香醛等作为漆酶漂白的天然介体,采用漆酶/天然介体体系处理桉木硫酸盐浆,使白度由41%ISO增加至67%ISO左右。Moldes等研究发现,漆酶/紫丁香醛体系与漆酶/HBT体系具有相近的催化漆酶脱木素效果。Arzola等发现紫丁香醛和乙酰丁香酮等天然介体具有与HBT、ABTS等合成介体相似的电化学稳定性。Caňas等用对香豆酸等催化漆酶处理废水中的多环芳烃化合物也取得了较好的效果。但关于漆酶/天然介体体系脱除木素的机理鲜有报道,因此研究漆酶/天然介体体系的木素脱除机理,有着重要的理论和现实意义。我们前期的研究表明,从蔗渣黑液木素降解可得到香草酸、香草醛、阿魏酸、紫丁香醛、丁香醛和对羟基苯甲醛等小分子酚醛类化合物,这些化合物可以作为漆酶脱木素/漂白的天然介体。本文以蔗渣硫酸盐浆为研究对象,以香草醛作为催化漆酶的模拟天然介体,对其进行了漆酶及漆酶/天然介体体系预处理,然后采用酶-弱酸水解两段法分离处理前后蔗渣浆的木素,并对制得的木素样品进行了傅里叶红外光谱(FT-IR)和核磁共振波谱(1H-NMR、13C-NMR)分析,得出漆酶/香草醛体系脱除木素的机理。1实验1.1漆酶、混合纤维素酶蔗渣硫酸盐浆为实验室自制纸浆,其kappa值为10.2,白度为38.0%ISO;漆酶和混合纤维素酶分别由宁夏夏盛实业集团有限公司和诺维信(中国)投资有限公司提供,其酶活分别为700IU/L和170FPU/mL;香草醛购于Sigma-aldrich公司。1.2漆酶/香草醛体系预处理蔗渣硫酸盐浆漆酶及漆酶/香草醛体系预处理是在PARR4843高压反应釜中进行,而螯合处理和过氧化氢漂白是在塑料袋中进行,具体工艺条件如下:漆酶预处理:漆酶用量15IU/g、pH4、浆浓10%、温度50℃、时间120min、氧压0.5MPa漆酶/香草醛体系预处理:漆酶用量15IU/g、香草醛用量2%、pH4、浆浓10%、温度50℃、时间120min、氧压0.5MPa螯合处理:EDTA0.2%、pH3.0、浆浓10%、温度70℃、时间60min过氧化氢漂白:H2O23%、NaOH2%、MgSO40.05%、浆浓10%、温度90℃、时间150min。1.3抽提液的制备首先,将风干的未处理、漆酶预处理及漆酶/香草醛体系预处理的蔗渣浆用苯-乙醇(体积比为2∶1)溶液在索氏抽提器上连续抽提20h。然后,再根据参考文献提出的方法,采用酶解-弱酸水解的两步法分离三种蔗渣浆中残余木素。最后将得到的木素样品经过乙醚洗涤数次,在40℃条件下真空干燥,即可得到比较纯净的木素试样。1.4木材素乙酰化经纯化的木素样品按照参考文献提出的方法进行乙酰化,得到的乙酰化木素样品主要用于核磁共振波谱分析。1.5红外光谱测定木素的光谱采用KBr压片法,在NicoletNexus红外光谱仪上测定木素样品的红外吸收光谱。样品用量为1.5mg木素/300mgKBr,测定波数为400～4000cm-1。1.6超声核磁共振谱ds木素的1H-NMR和13C-NMR分析是在中国科学院广州化学研究所一台德国BRUKER公司生产的DRX-400型400兆超导核磁共振谱仪上进行的。测定条件如下:溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6);外标为四甲基硅烷TMS;室温。扫描次数分别为32次(1H-NMR)和16500次(13C-NMR)。2结果与讨论2.1氧化氢漂浆的硬度实验分别对漆酶和漆酶/天然介体体系预处理的硫酸盐蔗渣进行了过氧化漂白。在没有添加任何介体的条件下,过氧化氢漂白纸浆的白度68.8%ISO;而添加香草醛作为天然介体后,其白度增加了6.4个ISO白度单位,为75.2%ISO。从后面的分析结果可以,因为添加香草醛作为介体后,经漆酶预处理后纸浆中羟基数量较未添加的多,且含有较多的羰基结构,增加了木素与过氧化氢反应的活性,说明香草醛可以作为漆酶预处理的介体。2.2红外光谱检测红外光谱除了用于木素结构和基团的定性分析外,也可用于定量分析各种功能基的变化。红外光谱用于定量分析木素的某些基团时,常用的是基线法。一般研究木素的红外光谱时采用1510cm-1或1600cm-1吸收峰为内标,也可以根据实际情况采用这些波数附近的吸收峰作为内标。以内标吸收峰的吸收强度为100%,其他峰吸收与之对比,即得出该吸收峰的相对吸收强度。本文是以1509cm-1吸收峰为内标,通过计算得到其他吸收峰的相对吸收强度。图1～图3分别为未漂蔗渣硫酸盐浆、漆酶预处理后纸浆和漆酶/香草醛体系预处理后纸浆中木素样品的傅里叶红外光谱图。图中各个吸收峰根据参考文献确定其归属,表1为不同木素样品红外光谱各峰归属及相对吸收强度。从图1-图3和表1中可知,波数为3419～3442cm-1范围内的吸收峰主要为木素结构中-OH的伸缩振动吸收峰,经漆酶单独处理后纸浆木素结构中-OH的相对吸收强度降低了约22%,而经漆酶/香草醛体系处理后纸浆木素中-OH基本保持不变,说明了漆酶可以氧化木素结构的酚羟基结构,但添加香草醛后,在氧化木素酚羟基结构的同时还会导致木素中的β-O-Ar和α-O-alk、α-O-Ar等醚键发生断裂,产生新的酚羟基,但由于处理过程中漆酶主要是木素酚型结构单元发生反应,导致木素结构的羟基的总量保持不变。波数为1640～1655cm-1的范围内的吸收峰是木素结构中共轭羰基(C=O)结构的吸收峰,其在蔗渣硫酸盐浆及其经漆酶和漆酶/香草醛体系预处理后纸浆中相对吸收强度为0.93、1.01和1.15,说明纸浆中的残余木素经漆酶或者漆酶/介体处理会发生木素侧链Cα位羟基的氧化,生成了α-羰基。2.3原料化学位移分析图4～图6为蔗渣的三种木素样品的1H-NMR谱图。表2为木素样品1H-NMR谱图的解析,标明了各个峰的归属。由图4～图6可以看出,在化学位移为δ2.19～2.49处,对于各种浆残余木素酚羟基的质子峰而言,蔗渣原浆残余木素的峰最高,其次是漆酶处理浆残余木素,经漆酶/介体体系处理后浆残余木素的最低,说明漆酶/介体体系处理能有效氧化酚羟基,产生羧基或醛基。在化学位移为δ8.00～9.80处,经漆酶/天然介体体系处理浆残余木素有明显的羧基及醛基质子吸收峰,而经漆酶处理浆残余木素和蔗渣原浆残余木素的则不明显。在苯环核质子区,化学位移为δ6.28～6.80、δ6.80～7.28、和δ7.30～7.80分别反映了紫丁香基(S)单元、愈创木基单元(G)和对羟苯基单元(H)苯环上质子的吸收峰。从图4～6以看出,δ6.28～6.80和δ6.80～7.28处的质子峰较强,而δ7.30～7.80处的峰相对较弱,说明该蔗渣木素样品中含有紫丁香基(S)单元、愈创木基(G)和对羟苯基单元三种单元,并以紫丁香基单元(S)和愈创木基单元(G)为主,对羟苯基单元(H)较少。在化学位移为δ5.74～6.28处,经漆酶/天然介体体系处理后的浆样比漆酶处理浆残余木素Ar-CH=CH上的β-H明显增多,这可能是由于部分β-O-4结构断裂引起的。2.4漆酶/天然介体体系对残余木素的降解效果图7～图9为蔗渣的三种木素样品的13C-NMR谱图,图上标明了各个样品在不同化学位移处的吸收峰以及各峰对应的化学位移值。表3为木素样品13C-NMR谱图的解析,标明了各个峰的归属。13C-NMR谱图通常分为3个区域:C=O区(化学位移δ160～220)、芳香区(化学位移δ101～160)和脂肪侧链区域(化学位移δ40～101)。从图8和图9可以看出,经漆酶/天然介体体系处理后残余木素的脂肪侧链区域吸收明显低于单独漆酶处理后木素的吸收,可能是由于木素发生了侧链氧化脱除反应,说明漆酶/天然介体体系对木素侧链的降解效果优于单独漆酶处理的降解效果。经漆酶/天然介体体系处理后的浆,其残余木素甲氧基含量明显少于仅有漆酶处理浆中残余木素甲氧基的含量,说明在漆酶/介体体系处理过程中,一部分甲氧基有可能被氧化发生脱除。对比化学位移值为δ128～129位置上的吸收峰,经漆酶/天然介体处理后木素的吸收比经单独漆酶处理浆残余木素的吸收而言明显增强,这是-CH=CH-的吸收特征,其吸收增大可能是由于漆酶/天然介体的作用使木素的侧链的β-O-4结构发生了断裂。蔗渣浆中木素经过漆酶/天然介体处理后在化学位移为δ120～123之间出现了两个峰,可能原因是漆酶/天然介体的作用使木素结构中的愈创木基结构侧链的α-碳发生氧化,从而使C-6位的位移值发生了偏向。δ152.3的峰是代表紫丁香基中的C3和C5,5一5’结构中的C3/C5。由图可知,单独漆酶处理浆中残余木素在此处吸收强于漆酶/天然介体体系处理浆残余木素的吸收,说明漆酶/天然介体体系处理较单独漆酶更易于使木素中的紫丁香基发生开环降解反应。另外经漆酶/天然介体处理后残余木素的羰基的吸收峰增加,说明由于漆酶/天然介体的氧化作用使部分羟基氧化成为羰基,导致预处理后纸浆的白度下降,但可以提高后续过氧化氢漂白的可漂性。3基于漆酶/介体体系处理的残余木素侧链c位羟基被氧化的-基(1)从漂白结果可以看出,添加香草醛作为介体,漆酶预处理蔗渣浆经过氧化氢漂白后,其白度可以增加6.4个ISO白度单位。(2)从FT-IR光谱分析可知,经漆酶/天然介体处理纸浆残余木素的共轭芳香羰基增加较多,漆酶单独处理浆残余木素次之,而原浆残余木素中的最少,说明纸浆中的残余木素经漆酶或者漆酶/介体处理会发生木素侧链Cα位羟基被氧化,生成了α-羰基。(3)从1H-NMR波谱图分析可知,漆酶/介体体系处理能有效氧化酚羟基,产生羧基或醛基;蔗渣木素样品中含有紫丁香基(S)单元、愈创木基(G)和对羟苯基单元三种单元,并以紫丁香基单元(S)和愈创木基单元(G)为主,对羟苯基单元(H)较少;