重组腺病毒感染猪流行性腹泻病毒的构建及免疫特性研究

重组腺病毒感染猪流行性腹泻病毒的构建及免疫特性研究

猪腹泻是由猪流行腹泻病毒（pedv）引起的一种高度接触性肠道感染疾病，以脱水、呕吐和脱水为临床特征（尹振等，1997）。PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属,其基因组为长约28kb的线性单股正链的RNA病毒,分为7个区,每个区有一个或两个开放阅读框(ORF),亚基因组之间有保守序列将其分开,基因组结构为5′-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-sM-M-N-3′,这些基因编码PEDV的4种结构蛋白和2种非结构蛋白,其中,S、sM、M、N基因编码结构蛋白,这些蛋白能够在细胞中自我组装成病毒衣壳,形成完整的病毒颗粒,且这些缺乏核酸的病毒衣壳能够诱导产生与完全病毒粒子相同的特异性中和抗体(Croizier等,2000)。由于该病暴发严重,又没有有效的商品化的疫苗,临床上多采取发病时用含强毒腹泻粪便病料“返饲”怀孕期母猪,使其产生抗体通过母乳而获得保护产房仔猪的方法。该方法虽然取得了一定的效果,但始终存在病毒扩散的风险。因此,疫苗接种仍是预防该病的主要手段。非复制型重组腺病毒是当前优良的基因转移载体,以其安全性好、表达量高而广泛应用,可经口服等多种途径感染靶动物(Morsy等,1998)。目前已有多个人用重组腺病毒基因工程产品上市。猪流行性腹泻重组腺病毒疫苗可经口接种,使抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径,有效地刺激黏膜免疫细胞产生分泌型IgA并引起全身性体液免疫应答(Gorbalenya等,2004)。2004年,Eduardo等成功地在杆状病毒表达系统中组装成SARS的病毒样颗粒,这为新型疫苗的研发提供了全新的视角。本研究旨在通过腺病毒载体实现PEDVsM、M、S基因的共同表达,并利用复制缺陷型重组腺病毒良好的基因转移工具,以期在免疫动物后在动物体细胞内组装成高表达含量的猪流行性腹泻病毒空衣壳,模拟自然病毒表面的线性的和非线性的抗原表位,刺激机体产生与自然病毒感染相近的免疫效果,为新型疫苗的研究奠定基础。1材料和方法1.1细菌细胞回复突变实验猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗由广东温氏食品集团馈赠;pMD18-TSimpleVector为TaKaRa公司产品;大肠杆菌DH5α、Vero细胞为华南农业大学兽医学院传染病实验室保存;AD-293细胞、腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMVVector、菌株BJ5183-AD-1感受态细胞、XL10-Gold超级感受态细胞、β-mercapto-ethanolmix(β-ME)均为Stratagene公司产品。1.2酶抑制剂及质粒提取rTaq酶、ExTaq酶、LATaq酶、PrimeScriptTM反转录酶,RNaseInhibitor,Oligod(T),限制性内切酶BglⅡ、XbaⅠ、XhoⅠ和EcoRⅤ、T4DNA连接酶及DL2000DNAMarker、250bpDNAMarker、λ-HindⅢdigest等均为TaKaRa公司产品;PmeⅠ、PacⅠ为NEB公司产品;DNA胶回收纯化试剂盒,质粒抽提试剂盒购自Omega公司;无内毒素质粒中量抽提试剂盒为Gene公司产品;LipofectamineTM2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品。1.3引物的设计与合成参照GenBank上发表的PEDVsM、M、S基因的序列,使用引物设计软件PrimerPremier5.0设计了5对引物(下划线部分为酶切位点),并送上海英骏生物工程有限公司合成。引物序列的各项参数见表1。1.4pcr扩增程序通过RT-PCR方法扩增出M、sM、S1、S2、S3基因,同时通过重组PCR技术扩增出全长S基因(图1)。PCR反应体系为:10×ExPCRBuffer5.0μL,dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL,上、下游引物(20pmol/μL)各1.0μL,cDNA模板4.0μL,ExTaq酶(5U/μL)0.25μL,ddH2O34.75μL。PCR扩增程序见表2。按DNA胶回收纯化试剂盒说明书操作回收PCR产物,然后将回收的PCR产物和腺病毒穿梭质粒Shuttle-CMVVector进行BglⅡ、EcoRⅤ双酶切,构建重组质粒pShuttle-sM、pShuttle-M。同法对回收的S基因PCR产物和腺病毒穿梭质Shuttle-CMVVector进行XhoⅠ、EcoRⅤ双酶切,构建出重组穿梭质粒pShuttle-S。将重组穿梭质粒的菌液送上海博尚生物工程有限公司进行测序,并进行序列分析。1.5pme酶切鉴定BJ5183感受态细胞已预转了腺病毒骨架质粒,其制备按常规化学感受态细胞制备方法进行。将重组穿梭质粒pShuttle-sM、pShuttle-M、pShuttle-S经PmeⅠ酶切过夜,回收,转化BJ5183感受态细胞。挑取10个最小的转化菌落,接种于5mLLB培养基中,振摇过夜。使用Gene公司大型质粒中量抽提试剂盒提取质粒,PacⅠ酶切鉴定,获得同源重组腺病毒质粒。1.6嘴唇感受态细胞取PacⅠ鉴定的重组质粒DNA1μL转化100μLXL10-Gold超级感受态细胞(使用Stratagene公司提供的β-ME)。培养、挑菌、扩增、提取纯化质粒,进一步PCR检测腺病毒表达质粒pAdeno-sM、pAdeno-M、pAdeno-S是否带有目的基因。1.7同治重组瘤毒物质的转染PacⅠ酶切同源重组腺病毒质粒过夜,回收,参考转染试剂盒说明书转染AD-293细胞。转染7d出现明显CPE,收获重组腺病毒。1.8重组瘤病毒基因的检测取连续扩大传代重组腺病毒和正常的AD-293细胞液各1mL,按常规方法提取基因组,通过RT-PCR检测目的基因。1.10重组腺病毒rad-sm、rad-m、rad-s感染veo细胞的检测sM、M、S蛋白在Vero细胞中的表达取1.7得到的重组腺病毒rAd-sM、rAd-M、rAd-S共同感染Vero细胞,37℃培养72h,收取细胞进行检测。1.11确立了表面活性剂分析和鉴定对收集的Vero细胞进行处理,离心取上清做SDS分析和Westernblotting鉴定。其中一抗为自制的抗PEDV的兔化血清(1∶100稀释),二抗为HRP标记羊抗猪抗体(1∶2000稀释)。1.12westernblotting免疫法检测小鼠血清抗体通过表达用1.10收集的Vero细胞表达上清分别0、2、4周免疫小鼠,同时设立空白对照,于5周龄收集血清,用猪传染性胃肠炎、流行性腹泻、猪轮状病毒感染三联疫苗作为抗原做Westernblotting检测抗体。2结果与分析2.1重组穿透质粒的构建M、sM、S基因的克隆及重组穿梭质粒的构建通过RT-PCR扩增出M、sM、S1、S2、S3、S4基因,结果见图2~5,同时应用重组PCR技术扩增出4152bp的S基因片段,结果见图6。将扩增出的目的基因和腺病毒穿梭质粒Shuttle-CMVVector进行双酶切,构建重组穿梭质粒。将重组穿梭质粒的菌液送上海博尚生物工程有限公司进行测序,序列分析结果表明,重组穿梭质粒中正确包含PEDVM、sM、S基因,成功构建了重组穿梭质粒pShuttle-sM、pShuttle-M、pShuttle-S。2.2同源重组质粒抗氧化酶切鉴定重组腺病毒质粒经过卡那霉素抗性筛选,PacⅠ酶切鉴定,电泳结果见图7。由图7可知,同源重组质粒pAd-sM酶切产生约23和3kb的两条带,同源重组质粒pAdM、pAd-S酶切得到约23和4.5kb的两条带,同源重组质粒对照电泳得到一条在加样孔以下的较大条带和一条约23kb条带,均与预期结果相符。以上结果表明转化BJ5183-AD-1后获得了同源重组腺病毒质粒pAd-sM、pAd-M、pAd-S。2.3脂质体转染ad-33细胞按常规方法培养细胞,细胞长至80%~90%满度且细胞状态良好时,对同源重组腺病毒质粒pAd-sM、pAd-M、pAd-S分别进行脂质体转染AD-293细胞,8d内细胞完全病变,出现典型CPE,细胞变圆,细胞核固缩,最后脱落,结果见图8。将获得的病毒命名为rAd-sM、rAd-M、rAd-S。2.4rad-sm、rad-m、rad-s的tcid50将病毒液接种于生长状态良好的AD-293细胞,逐日观察,细胞在接种病毒6d左右开始出现细胞病变,纯化后测得rAd-sM、rAd-M、rAd-S的TCID50分别为10-8.19/mL、10-8.41/mL、10-7.29/mL。2.5目的基因rt-pcr扩增检测ero细胞的扩增能力腺病毒rAd-sM、rAd-M、rAd-S共同感染的Vero细胞72h后,收获感染腺病毒的Vero细胞和正常的Vero细胞,通过PCR、RT-PCR进行目的基因DNA和转录水平的检测,电泳得到大小约为231、681和1498bp的特异性条带(图9),与预期结果相符。Westernblotting检测可见在26、72、170ku左右出现棕色印迹,与预期蛋白大小一致,而正常细胞均无此印迹(图10),证实sM、M、S基因在AD-293细胞都得到成功表达。2.6westernblotting检测共感染的Vero细胞表达上清分别通过肌注和口服两种途径免疫小鼠,分离血清,以猪传染性胃肠炎、流行性腹泻、猪轮状病毒感染三联疫苗作为抗原,1∶25倍稀释待检血清作为一抗,1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,进行Westernblotting检测,结果见图11。由图11可知,两种方式免疫小鼠均有PEDV的特导性抗体产生。3多个重组病毒共同感染多个细胞自PED出现以来,对疫苗的研究一直在进行,中国也成功研制了氢氧化铝组织灭活苗和细胞弱毒苗(倪艳秀等,2001;刘岩等,2007),但效果并不是很理想;多种基因工程疫苗的出现很大程度上克服了传统疫苗的缺陷,在疫苗的发展中具有重要作用,但其免疫原性较低(非感染性的病原亚单位如蛋白、肽或糖等),尽管有佐剂的配合,仍不能达到理想的免疫效果(Morsy等,1998)。因此,开发出能够诱导保护性免疫应答的安全高效廉价的新型疫苗对疫苗生产工业来讲是一个巨大的挑战,而病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)的出现为新型安全高效的疫苗及新型佐剂的开发提供了一个新的契机。在细胞中构建VLPs,首要条件是在同一细胞中各种必需蛋白能够同时表达,且要有高的表达量。因此可以通过多个重组病毒共同感染一个能够同时表达多个病毒蛋白的细胞或构建一个能够同时表达多个病毒蛋白的重组病毒来实现(Noad等,2003)。这两种方法各有特点,共感染可以保证外源蛋白的高水平表达,但形成共感染细胞的几率较低,因而VLPs形成效率必然会受到影响;构建表达多个病毒蛋白的重组病毒,虽然在单一蛋白的表达量上可能有所降低,但所有蛋白出现在同一细胞中的几率较高,有利于VLPs的构建。2004年,Eduardo等成功地应用杆状病毒表达系统,通过多个杆状病毒共同感染昆虫sf细胞,得到组装的SARS病毒样颗粒(Eduardo等,2004),这为多个重组病毒共同感染一个能够同时表达多个病毒蛋白的细胞形成VLPs提供了现实依据,因此本试验通过选择多个重组腺病毒共同感染一个能够同时表达多个病毒蛋白的细胞这种方法来对形成VLPs进行探索。首先通过AdEasyTMXLAdenoviralVectorSystem,构建分别含有sM、M、S基因的PEDV重组腺病毒,然后共同感染具有其受体CT