发酵萃取耦合法制备丙酮丁醇的研究

发酵萃取耦合法制备丙酮丁醇的研究

由于缺乏可支配能源，利用酶或微生物生产可支配能源的工业生物技术已成为寻找环境友好能源的有效途径。近年来,科学家研究发现基于微生物细胞生产的丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料。丙酮丁醇发酵法(即ABE发酵,简称丙丁发酵)是生产丁醇的传统方法,产物主要是丁醇、丙酮和乙醇(质量比6∶3∶1),但影响此法溶剂产量的限制因素是发酵产物对微生物细胞的毒性,其中丁醇是毒性最大且是唯一的发酵浓度处于抑制性浓度范围内的溶剂。以己糖为碳源的培养物中,4～4.8g/L为丙酮丁醇羧菌生长受到抑制的临界浓度;在工业发酵过程中,当丁醇浓度达到13g/L,溶剂生产基本停止,而此浓度也是传统丙丁发酵所能达到的最大丁醇产量,因而造成低丁醇产量和低底物转化率,导致丁醇生产成本的提高。丁醇低产量的解决可从下游工艺着手,即不断移出发酵液中丁醇使产物抑制作用降低以提高丁醇产量。近年来,国内外许多研究者围绕此原理开展了利用气提、液液萃取、渗透萃取、渗透蒸发工艺解决传统丙酮丁醇发酵问题的研究工作。其中,发酵萃取耦合工艺的原理是将与水不互溶的有机萃取剂与发酵液混合,因丁醇在有机相中比在水相中溶解度大而浓缩在有机相中,待与发酵液分离后萃取相可经精馏或反萃取使溶剂得到再生而循环使用,而丁醇产量和产率也因发酵液中产物抑制作用的消除而得到提高。萃取剂的选择要满足以下要求:较好的生物相容性(尽量不毒害生产菌种);与水相不互溶;对发酵产物选择性分离,且分离系数较大;有机相用量尽量少;有机溶剂成本低廉。在常用的萃取剂中,Evans等筛选出油醇(丁醇分离系数3.2)为生物相容性较好的萃取剂,且向生物相容性好但分离系数低的油醇中加入生物相容性差分离系数高的癸醇(丁醇分离系数6.2)后,此种萃取剂使以CBM为培养基的丙丁发酵产物丁醇产量得到提高。但在工业化生产过程中,以固体培养基为丙丁发酵培养基时,将会面临有机相和培养基的乳化的问题,而有机萃取相的配比、用量等工艺参数同样是工业化生产所需要解决的问题。本文通过冷模试验、生长影响试验和小规模发酵试验,确定了有机相条件和发酵萃取耦合工艺,为工业化发酵生产参数的探索奠定了基础。1材料和机器1.1病毒丙酮丁醇梭菌(ClostridiumacetobutylicumSMB1),中国微生物菌种保藏中心。1.2氮气成为厌氧环境RCM培养基:酵母粉3.0g/L,水解酪蛋白10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,葡萄糖5.0g/L,淀粉10.0g/L,氯化钠5.0g/L,醋酸钠3.0g/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L,经抽真空充氮气后成为厌氧环境,121℃,15min灭菌。发酵培养基(9%的玉米培养基):玉米粉9g,定容至100mL,121℃,30min高温灭菌。1.3油-0%醇,乙氧醇,总溶液。10.混合溶液Ⅰ:15.00g/L总溶质的混合溶液,含丁醇9.00g/L,丙酮4.50g/L,乙醇1.50g/L。混合溶液Ⅱ:35.00g/L总溶质的混合溶液,含丁醇21.00g/L,丙酮10.50g/L,乙醇3.50g/L。有机相Ⅰ:油-0%癸醇:体积分数100%油醇,体积分数0%癸醇。有机相Ⅱ:油-20%癸醇:体积分数80%油醇,体积分数20%癸醇。有机相Ⅲ:油-40%癸醇:体积分数60%油醇,体积分数40%癸醇。丁醇、乙醇、丙酮(色谱纯),美国Sigma-Aldrich公司。油醇、癸醇(化学纯),北京恒业中远化工有限公司。1.4hpx-97h型液相色谱仪;Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);AminexHPX-87H型液相色谱柱(美国Bio-Rad公司);GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司);DB-WAXGC毛细管色谱柱(30m×0.25mm,美国Agilent公司);紫外-可见分光光度计2802PC(美国Unico公司)。2方法2.1在冷模型试验中，确定了有机相比的比较方法2.1.1萃取溶剂的选择按1∶5的相比(有机相和水相的体积比)分别将有机相Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ缓缓加入到混合溶液Ⅰ、Ⅱ上方,形成6种稳定两相,保持两相平稳置于37℃水浴摇床中进行萃取,摇床转速为80r/min。分别于0.5,1,1.5,36h的萃取时间,从下层水相取样并用HPLC测丁醇含量,计算不同萃取时间各有机相对水相中丁醇的萃取率。2.1.2摇床转速测试将按2.1.1方法形成的6种稳定两相置于37℃水浴摇床进行萃取,摇床转速为80r/min。于萃取时间1.5h从水相取样,测丁醇、丙酮和乙醇含量,并计算1.5h各有机相对水相中各物质的萃取率,对比各有机相对水相萃取1.5h后,丁醇、丙酮和乙醇的萃取率差别。2.1.3摇床萃取水据2.1.1方法,按照1∶1,1∶3,1∶5,1∶7(有机相∶水相)的相比将有机相加入到水相上方,并置于37℃水浴摇床进行萃取,摇床转速为80r/min。于萃取时间1.5h从水相取样,测丁醇、丙酮和乙醇含量,并计算1.5h各有机相对水相中丁醇、丙酮和乙醇的萃取率,对比萃取1.5h后,各有机相对水相中丁醇萃取率的差别。2.1.4计算有机丁醇、丙酮和乙醇提取率的方法有机相对水相中各物质的萃取率=(水相中该物质的起始含量-水相中测得的该物质终含量)/水相中该物质的起始含量×100%。2.2油-20%苏-20%5将油-20%水相扩大成网后,油-40%b稳定性成高效5-10h的油-20%/l0h,以4%的接种量分别向水相RCM培养基中接入活化的菌种ClostridiumacetobutylicumSMB1,再将油-20%癸醇和油-40%癸醇分别按照1∶5相比加到水相上,形成稳定的两相,并置于37℃,100r/min摇床开始培养至48h。从0h起始,分别于0～48h每4h取1mL菌液,用蒸馏水稀释3倍,用分光光度计测量600nm下菌液的OD值,制作48h内不同癸醇比例影响下的菌体生长曲线,设置对照组为不加入任何有机相的水相中菌体生长曲线。2.3丙酮丁醇、乙醇、丙酮的产量测定0h接活化的生产菌种ClostridiumacetobutylicumSMB1于9%的玉米培养基中,分别于0,12和24h按1∶5相比将油-20%癸醇缓缓加在玉米培养基之上,37℃发酵72h后,取水相发酵液和有机相样品,分别用HPLC法和气相色谱法测量丁醇、乙醇、丙酮的产量。对照组设置为不加入任何有机相的丙酮丁醇发酵,试验组和对照组均重复2次求平均值。最后综合两相产量,分别计算生产菌的丁醇、丙酮和乙醇总产量,计算公式:各产物总质量浓度(g/L)=(有机相的该产物质量浓度×有机相的体积+水相的该产物质量浓度×水相的体积)/水相体积。2.4滤膜的制备水相样品经12000r/min离心10min,0.2μm滤膜过滤备用。流动相为0.05mmol/L的硫酸,流速为0.5mL/min,调节柱温为15℃,进样20μL后检测45min。2.5氮气条件下程序升温有机相样品经12000r/min离心10min,0.2μm滤膜过滤后备用。载气为氮气,流速14mL/min,进样量10μL。采用程序升温:70℃,保持5min;升温速率10℃/min,终温130℃,保持3min;升温速率20℃/min,终温230℃,保持20min。进样口温度为250℃,检测器温度为250℃。3结果和分析3.1冷模型试验决定了有机相萃取剂的提取效果3.1.1萃取率的提高如图1和2所示,对15g/L混合溶液Ⅰ和35g/L混合溶液Ⅱ进行的丁醇的萃取结果均为,1.5h内随着时间的延长,有机相对水相中丁醇的萃取率相应提高;1.5～36h丁醇萃取率与1.5h几乎相同,不再增大。这表明1.5h就可达到有机相最大萃取率,而此时混合溶液Ⅰ和Ⅱ中残留的丁醇浓度分别为4.5g/L和10.5g/L,低于使溶剂完全停止生产的丁醇浓度。因而,油醇和癸醇组合使用的有机相可在较短时间内使发酵液中的产物丁醇降低到不影响生产菌正常生产的浓度。3.1.2其它有机溶剂萃取如图3和图4所示,1.5h,各有机相对混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ进行的萃取结果为,对丁醇的萃取率均为50%以上,对丙酮和乙醇的萃取率分别在20%以下和10%以下。有机相对水相中丁醇和丙酮、乙醇萃取率的差别悬殊,反映了这种油-癸醇体系作为有机相对丁醇的特异性选择萃取效果。这种针对于丁醇的选择特异性萃取,就使水相中丁醇产物抑制作用得以及时消除,将会方便实际发酵中丁醇产量增大;虽然丙酮和乙醇也有部分被有机相移出水相之外,但产物消除造成的产量增大远不如丁醇的效果,因此,使实际发酵过程中丁醇、丙酮、乙醇以越来越大于6∶3∶1的比例产出,而这正符合了工业生产中尽量提高丁醇/丙酮产量比的要求。所以,油-癸醇体系的有机相对丙丁发酵液中丁醇的萃取快速、特异,满足发酵萃取工艺对有机相的要求。3.1.3有机相对混合溶液的萃取率如图5所示,随着相比增大,各有机相对混合溶液Ⅰ和Ⅱ中的丁醇萃取率增大趋势显著,且相比为1∶1,1∶3和1∶5时,各有机相对混合溶液Ⅰ和Ⅱ中的丁醇萃取率均在50%以上,保证了起始浓度在9～21g/L范围的丁醇,被有机相萃取后留在水相中的浓度小于使溶剂生产完全停止的浓度;但当相比为1∶7时,除油-40%癸醇的有机相对混合溶液Ⅱ的萃取率略高于50%外,3种有机相对混合溶液Ⅰ和Ⅱ的丁醇萃取率均小于50%,难以符合工业化发酵萃取生产丁醇的萃取要求。因而,从丁醇萃取效果、有机相溶剂成本及尽量减少有毒溶剂用量的角度考虑,选择相比为1∶5。3.2有机相通过毒性对菌体生长的影响由图5可知,相比为1∶5时,癸醇比例为40%时对水相的丁醇萃取率要比20%时相应值大。但由图6可以看出,分别按1∶5相比加入有机相油-20%癸醇和油-40%癸醇后,虽然菌种仍能在48h内呈现出和对照菌种相似的生长趋势,但仍低于对照组菌体密度值,可见有机相通过毒性对菌体生长略有抑制;而在0～48h生长过程中,油-20%癸醇为有机相的菌体密度总是略大于油-40%癸醇为有机相的菌体密度,这反映出癸醇比例越大将会对菌体毒性越大。因而选择生物相容性更好的油-20%癸醇为有机相。3.3有机相对丁醇和总溶剂产量比的影响0h加入有机相后,有机相在1h内逐渐和玉米培养基完全混合,难以形成稳定两相,因而生产菌将受到有机相的毒害,溶剂生产能力降低,丁醇和总溶剂产量下降。分别于12h和24h加入有机相,经72h发酵后,试验组和对照组的丁醇和总溶剂产量分别如图7所示,24h加入有机相的试验组,其丁醇和总溶剂产量比对照分别提高了23.99%和13.33%,12h加入有机相的试验组,其丁醇和总溶剂产量比对照分别减小了62.72%和64.91%。24h加入有机相得到的丁醇总产量比对照提高了近1/4,这表明有机相确实发挥了从水相中萃出丁醇提高丁醇产量的作用,而相对于对照组的总溶剂产量的提高值(13.33%)少于丁醇产量的提高值(23.99%),这也印证了有机相对丁醇的选择性萃取作用增大了丁醇/丙酮的产量比。12h加入有机相的试验组得到丁醇和总溶剂的产量比对照下降了很多。通过观察,发现12h加入有机相后未能形成稳定的两相,而是有机相和培养基混合在一起。因此,推测是由于乳化作用,使有机相有机会和培养基中的生产菌种接触且毒害细胞,造成细胞生长受到抑制,正常生理功能被阻碍,溶剂产量降低。4优化发酵条件本试验通过冷模试验、菌体生长曲线和发酵萃取试验,确定