灵芝菌丝体总蛋白提取方法的研究

灵芝菌丝体总蛋白提取方法的研究

2012年，中国科学家利用最新的高流量比色技术和光学谱技术独立完成了《苔藓体水平》的详细家谱，并在矩阵模型中发现了新的代谢功能基因和调节元素。这为重建代谢网络、保护和创新针灸材料奠定了基础。推动苔藓成为第一个“假药”。通过代谢工程来改造或研究细胞代谢途径的关键酶,从而提高灵芝免疫调节蛋白的产量蛋白质组学研究通过对生物体内表达的各种蛋白质进行识别和定量分析,确定它们在细胞内外的定位、修饰、相互作用和功能,以期获得对生命本质和活动规律的全景式认识1材料和方法1.1实验材料1.1.1培养基的制备韦伯灵芝(Ganodermaweberianum)采自广州花都芙蓉彰,由本研究组分离纯化得韦伯灵芝菌株TZC-1综合PDA培养基:马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、KH发酵培养基:综合PDA培养基中去掉琼脂,加入酵母膏5g/L,pH=4.8。1.1.2酰胺丙基、双酰胺、双酰胺、tis碱和3.1酯类尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂混合物、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris碱等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白分子量标准品购自Fermentas。1.2实验方法1.2.1新鲜病原菌球的制备韦伯灵芝菌丝经斜面活化后,转接到综合PDA平板上,26℃培养5d,用无菌打孔器将平板菌种制成直径10mm,厚2mm的菌种塞,将菌种塞接种到装有100mL发酵培养基的300mL锥形瓶中,每瓶接入3个菌塞,在26℃、160r/min条件下恒温震荡5d,用蒸馏水反复清洗菌丝球5次,最后用滤纸反复吸干菌丝体水份,获得新鲜菌丝球。1.2.2生长巨酶lma法参考胡斌斌发表的真菌总蛋白质提取方法方法1:向预冷的研钵中加入适量的菌丝体,研钵置于冰上,将菌丝体研磨成粉末;称取100mg菌丝粉末,加入750μL裂解液(8mol/L尿素,2.5mol/L硫脲,1.5mmol/LEDTA,10mmol/LTris,20mmol/LPMSF)悬浮起菌丝粉末;4℃冰浴30min,期间每隔5min混匀一次;用超声波细胞破碎仪在冰浴中破碎菌体(750W,超声6s,间隔1s,超声20次);4℃12000r/min离心10min,弃沉淀保留上清液。方法2:向装有液氮的研钵中加入适量的菌丝体,研钵置于冰上,在液氮中将菌丝体研磨成粉末,接着按方法Ⅰ完成。方法3:向装有液氮的研钵中加入适量的菌丝体,研钵置于冰上,在液氮中将菌丝体研磨成粉末;加入750μL提取液Ⅰ(8mol/L尿素,2.5mol/L硫脲,1.5mmol/LEDTA,10mmol/LTris,20mmol/LPMSF或不同浓度的蛋白酶抑制剂混合物)。4℃冰浴60min;加250μL提取液Ⅱ(4%CHAPS,4%DTT,0.5%SDS),涡旋30s×6次,间隔1min置于冰上;4℃10000r/min离心10min,弃沉淀保留上清液。1.2.3测定蛋白质浓度蛋白质浓度按Bradford法1.2.4上样电泳采用等体积上样的方法,取提取的蛋白质溶液15μL加3.7μL上样缓冲液,混匀后取12μl进行上样,电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝进行染色处理。2结果与分析2.1控制好时间灵芝菌丝经发酵后,收集的菌丝球用蒸馏水反复洗涤可防止培养基中蛋白组分的污染;洗涤过的菌丝体含大量水分,需要用滤纸吸干,有利于在液氮中研磨成粉末。制备菌丝体时,需要控制好时间,菌丝样品正常呈淡黄色(图1A),如果菌丝干燥后暴露在空气中时间过长,菌丝将会变成褐色(图1B)。实验结果显示:在相同提取条件下,以褐色菌丝体为材料提取的蛋白质浓度明显低于淡黄色菌丝体。2.2蛋白质浓度检测实验通过超声波、超声波联合液氮冷冻研磨和液氮冷冻研磨等三种方法破碎灵芝菌丝细胞壁,采用高浓度尿素-硫脲法来溶解细胞蛋白质组,所制备蛋白样品经SDS凝胶电泳和按Bradford法测定蛋白质浓度,根据电泳图谱及蛋白质浓度来评估不同方法的效果。从电泳图谱(图2)分析,超声波法所得到的样品中蛋白质数量较其他两种方法少,蛋白条带不清晰,分布不均匀,主要集中在低分子量14.4~45.0kDa范围;超声波联合液氮冷冻研磨法提取的样品中蛋白质条带丰富,分布均匀,但条带不很清晰,泳道两侧拖带严重,推测可能是部分降解所致;液氮冷冻研磨法提取的样品中蛋白质数量与超声波联合液氮冷冻研磨法提取的蛋白质数量基本一致,蛋白条带丰富,分布均匀,条带清晰。三种方法提取样品的蛋白质浓度分别为:9.95±0.41、17.47±0.39和15.85±0.54mg/g菌丝。根据电泳图谱和蛋白质浓度来比较,认为方法Ⅲ的提取方法适合灵芝菌丝体蛋白质组的制备。为了优化方法Ⅲ,提取液I中使用不同种类和不同浓度的蛋白酶抑制剂,分析所提蛋白质的质量,其结果表明(图3):5种浓度的蛋白酶抑制剂混合物和20mmol/LPMSF所提取的蛋白质样品的电泳图谱没有明显差异,蛋白质条带都比较清晰且条带的丰富性较好,条带分布均匀;所有样品的蛋白质浓度均不存在显著性差异(表1)。从结果可以判断,PMSF和蛋白酶抑制剂混合物均能很好地抑制灵芝菌丝内源的蛋白酶,防止所提取蛋白质降解,且与蛋白酶抑制剂混合物的浓度无关。3蛋白质提取方法的筛选在灵芝蛋白质组学及灵芝转基因菌株生产重组蛋白的研究中,获取菌丝胞内蛋白质,并保持其完整性是研究的首要问题,其质量的好坏直接影响蛋白质表达分析研究的开展及其结果的准确性。因此,建立一种高效的菌丝体总蛋白的提取方法对作为“模式药用真菌”灵芝生物学研究具有十分重要的作用。真菌的细胞壁破碎是提取蛋白质效果好坏的关键。已知灵芝细胞壁具有坚固的双层结构,由肽聚糖骨架组成,聚糖链上所存在的肽