破壁方法对雨生红球藻湿藻中虾青素提取的影响

破壁方法对雨生红球藻湿藻中虾青素提取的影响

虾青素是脂肪溶解度的类胡同。它具有很强的自由基和急救活动性氧气的活性。由于雨生红球藻厚壁孢子具有厚且致密的孢粉质细胞壁本文以高含水量雨生红球藻湿藻泥为原料,比较研磨、酸解、碱解、热蒸汽和酶解等多种方法破壁处理方式对其细胞总类胡萝卜素和总脂肪提取效率及其组成的影响,旨在找到一种既可保留虾青素活性,又能明显提高虾青素提取效率的破壁方法。1材料和方法1.1藻类和原生动物保藏中心雨生红球藻(HaematococcuspluvialisSCCAPK0084)藻株购买自丹麦斯堪的纳维亚藻类和原生动物保藏中心(ScandinavianCultureCollectionofAlgaeandProtozoa,Denmark)。藻细胞经第一步培养:3N-BBM培养基、持续光照(50μmol/m1.2方法1.2.1热蒸汽处理称量500mg的雨生红球藻湿藻生物质于试管中,分别按照以下方法进行破壁处理:(1)研磨:使用研钵将湿藻细胞在液氮和黑暗条件下研磨2min,之后使用磷酸盐缓冲液(pH7.8,共5mL)将细胞转移至试管中;(2)酶解:加入5mL磷酸盐缓冲液(pH7.8)和蜗牛酶(藻细胞干重的0.5%),在37℃下搅拌12h;(3)酸解:加入5mL0.7mol/L的硫酸溶液,在60℃下搅拌15min;(4)碱解:加入5mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液,在60℃下搅拌15min;(5)热蒸汽处理:加入5mL磷酸盐缓冲液(pH7.8),在高压灭菌锅中121℃处理20min;(6)对照:加入5mL磷酸盐缓冲液(pH7.8)。以不经破壁处理的完整细胞作为对照组。1.2.2红球藻总含量的测定藻细胞经低温冻干之后,按照文献1.2.3混合溶剂研磨法雨生红球藻色素提取物中色素的定性分析采用硅胶板薄层色谱法,上样后,使用乙醚∶己烷混合溶剂(V/V=40∶60)展开100%,取出待溶剂挥发后拍照。雨生红球藻色素提取物中单一类胡萝卜素含量分析测定采用Yuan等1.2.4分层色谱分析破壁处理后的雨生红球藻细胞经冻干机冷冻干燥之后,使用氯仿∶甲醇混合溶剂(V/V=1∶2)提取细胞总脂肪,合并有机相后加入氯仿和水,使氯仿∶甲醇∶水的配比为1∶1∶0.9(V/V),充分摇匀后静置分层。收集下层氯仿相,氮气吹干后称重脂肪组成使用薄层色谱法分析,展开条件为:(1)苯∶氯仿∶无水乙酸∶甲醇混合溶剂(V/V/V/V=150∶60∶2∶17.7)展开70%;(2)苯∶己烷混合溶剂(V/V=1∶1)展开至100%。展开完毕待溶剂挥发后使用碘蒸汽显色。使用甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、甘油单酯(MAG)、固醇酯(SE)、固醇(FS)等作为标准品。1.2.5脂肪酸成分分析油脂提取物依照文献[20]的方法进行酯化后使用气相色谱-质谱测定其脂肪酸组成。以十九烷酸甲酯(C式中:m2结果与讨论2.1不同破壁方法对雨生红球藻虾青素的影响雨生红球藻湿藻细胞经研磨、酶解、酸解、碱解、热蒸汽处理等不同方法破壁后细胞中的总类胡萝卜素含量如图1所示。碱解后细胞的总类胡萝卜素含量略低于对照组,研磨和热蒸汽处理对总类胡萝卜素含量无明显影响,而酸解和酶解处理下总类胡萝卜素含量反而高于对照组。酸解和酶解处理后获得的总类胡萝卜素含量可能是由于破壁过程破坏了雨生红球藻的细胞壁结构以及减弱了虾青素分子与细胞内容物的键合,从而有利于溶剂进出细胞并更易于胞内虾青素的溶出雨生红球藻色素提取物含有酯化虾青素(包括虾青素双酯和虾青素单酯)、微量的游离虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素和叶绿素等其它组分。分析结果表明,经不同方法破壁处理后,雨生红球藻的细胞色素组成发生明显的变化。碱解处理后,雨生红球藻色素提取物中存在明显高于其它所有试验组和对照组的游离虾青素条带(图2),游离虾青素的含量为4.33mg/g,比对照组提高了20倍;与此同时,虾青素单酯和虾青素双酯的含量分别降低至15.60和2.81mg/g(表1)。与对照组相比,碱解后3种形态虾青素的总含量基本相同,说明增加的游离虾青素主要来源于酯化虾青素的反应产物,很可能是酯化虾青素在碱作用下发生皂化反应生成游离虾青素雨生红球藻经酸解或酶解破壁后,其胞内虾青素组成与对照相比无明显区别(图2)。说明虾青素的化学性质对硫酸相对稳定。曾有文献报道虾青素分子在4mol/L的盐酸中也保持稳定而不发生明显降解热蒸汽处理(121℃)后细胞中虾青素的组成与对照组相比无明显变化(图2,表1)。以前曾有文献报道虾青素暴露于60℃下1h的损失率低于22.2不同破壁方法对破壁效果的影响当用高含水量雨生红球藻湿藻泥进行虾青素油脂提取时,疏水溶剂几乎不能通过湿藻细胞表面水膜渗透进入完整的湿细胞内部;只有当细胞壁破裂后,胞内脂溶性色素逸出至胞外才能被疏水溶剂萃取。为准确反映不同破壁方法对破壁效果的影响,我们以食用植物油作为破壁处理后湿细胞中虾青素提取的溶剂,以总类胡萝卜素提取效率来衡量细胞破壁率。未经破壁的湿藻细胞,其胞内类胡萝卜素几乎不能被植物油萃取出来(图3),主要是由于完整细胞壁和胞外水层的阻碍本研究测试的多种破壁方法中,蜗牛酶酶解破壁对总类胡萝卜素提取效率最高,达到9.4mg/g(图3),显著优于Kobayashi等利用单一的细胞裂解酶或纤维素酶处理雨生红球藻以提高类胡萝卜素提取效率的效果2.3破壁处理对雨生红球藻脂肪和脂肪酸的影响在雨生红球藻中,虾青素几乎全部溶解并储藏于胞内的脂肪体中,因此虾青素提取往往伴随着胞内油脂的提取。研究证实,一方面,分子与脂肪酸结合成酯,而延缓其构型转化和降解薄层色谱分析结果表明,雨生红球藻脂肪的主要成分随破壁处理方法不同而出现很大差异。与对照组相比,碱处理后提取的脂肪中甘油三酯几乎消失,而伴随出现大量的脂肪酸甲酯条带和微弱的甘油二酯条带(图5)。甘油三酯的消失很可能是脂肪酸甲酯在碱解破壁中发生了严重的转酯化反应GC-MS结果表明,雨生红球藻脂肪酸组成以C3球藻湿藻细胞主要营养成分含量和组成的影响破壁处理是提高雨生红球藻的虾青素提取效率的重要途径。本文比较研究了研磨、酸解、碱解、热蒸汽和酶解等多种破壁处理方法对雨生红球藻湿藻细胞总类胡萝卜素和总脂肪提取效率及其组成的影响。酶解和酸解能够显著提