响应面法优化杨梅果实中抗氧化物质的提取工艺

响应面法优化杨梅果实中抗氧化物质的提取工艺

杨梅科、杨梅科、多年生乔木。杨梅原产于中国,属于热带果树,喜温暖湿润气候,耐阴,不耐强烈光照杨梅共有50多个品种,根据成熟果实的色泽可将其划分为乌种、红种、粉红种和白种超声辅助提取是一项高效的天然产物辅助溶剂提取技术,超声波产生的热效应、机械作用和空化效应可以使原料细胞壁快速破碎,促进提取剂进入细胞内与目标提取成分充分混合,加速胞内物质溶出、扩散和释放,有助于提取效率的提高杨梅色泽鲜艳,果实中除了含有碳水化合物外,还含有丰富的抗氧化物质,主要有花色苷、黄酮类、多酚类、鞣质类等。目前国内外研究色泽与花色苷稳定性的关系居多,然而,有关杨梅色泽与抗氧化物质含量的关系鲜有研究报道。本试验中通过超声辅助提取杨梅果实抗氧化物质,采用响应曲面法优化提取工艺,并探讨杨梅果实抗氧化物质稳定性以及色泽与抗氧化活性物质含量的相关性。1材料和方法1.1-4制冷杨梅,采摘已完全成熟的果实,用保鲜车当天运回,贮藏在-4℃冷库中,备用。无水乙醇、过硫酸钾、ABTS2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、氯化钾、醋酸钠、碳酸钠(以上试剂均为分析纯级)、福林酚。1.2u3000解决kma手持自动色差计,柯盛行(杭州)仪器有限公司;20/404UV分光光度计,GBCcintra;ArantiJ-E型高速冷冻离心机,BeckmanCoulter公司;KQ5200DB型数控超声波清洗器,昆山市超生仪器有限公司。1.3测试方法1.3.1abtsabts工作液的配制采用ABTS法测定杨梅果实提取物的抗氧化活性。过硫酸钾与ABTS溶液反应形成蓝绿色的ABTSABTS工作液的配制:将5mL7mmol/LABTS和88μL140mmol/L过硫酸钾溶液混合,在室温、避光条件下静置12~16h,形成ABTS1.3.2提取工艺的单一要素优化1.3.2.超声时间对杨树莓原汁抗氧化活性物质的影响取液氮研磨后的杨梅果实1g,乙醇体积分数70%,料液比1∶20(g/mL),置于50mL离心管中超声提取,设置超声时间为20,40,60,80min和100min,在40℃分别超声,10000r/min离心10min,取其上清液,并计算杨梅果实提取物中抗氧化活性物质含量(以trolox物质的量表示),比较得出最佳超声时间。1.3.2.最佳料液比的确定取经液氮研磨后的杨梅果实1g,乙醇体积分数70%,提取温度40℃,设置料液比分别为1∶10,1∶20,1∶30,1∶40和1∶50(g/mL),按照确定的最佳超声时间超声提取,方法同本文1.3.2.1节,比较后得出最佳料液比。1.3.3.乙醇体积分数取经液氮研磨后的杨梅果实1g,提取温度40℃,设置乙醇体积分数分别为40%,50%,60%,70%,80%和90%,按照确定的最佳超声时间和料液比,在超声清洗器中超声,方法同1.3.2.1节,比较后得出最佳乙醇体积分数。1.3.3.超声温度对超声清洗器的超声效果的影响取经液氮研磨后的杨梅果实1g,按照已确定的最佳超声时间、料液比和乙醇体积分数,分别设置超声温度20,30,40,50℃和60℃,在超声清洗器中超声,方法同1.3.2.1节,比较后得出最佳超声温度。1.3.4因素水平的构建在以上研究基础上,选取料液比、乙醇体积分数和超声时间为考察因素,以提取液活性物质的trolox物质的量为指标进行3因素3水平的Central-Composite试验设计,其因素水平编码见表2。通过响应面(RSM)分析获得最佳提取工艺。1.3.5杨树果的抗逆性稳定试验1.3.5.1.温度对杨树果的氧化物质稳定性的影响将在最佳工艺条件下提取的杨梅果实浸提液分别于-20,4,25℃避光下存放3d。以蒸馏水校零,每24h测其清除ABTS1.3.5.2ph对杨树果氧化物质稳定性的影响参照赵丽等1.3.5.3、光对杨树果酸氧化物质稳定性的影响参照方忠祥等1.3.5.4.金属离子对杨树果实氧化性能的影响精密称取NaCl、KCl、无水MgSO1.3.6李树果实的颜色与氧化活性的关系1.3.6.1.杨树果色泽测试采用全自动色差计测定杨梅果肉的色泽。以亮度值(L1.3.6.2.颜色含量的测定参考曹建康式中,M1.3.6.超声提取法总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteau方法。取1g研磨后的杨梅果肉置于10mL离心管中,加入5mL80%乙醇,超声提取30min,离心后取上清液。准确量取0.5mL提取液于25mL刻度试管中,用蒸馏水定容6mL,摇匀,加1mL福林酚试剂,充分摇匀,1min后,加入20%碳酸钠溶液1.5mL,混匀定容,30℃避光0.5h,于波长760nm处比色法测定吸光值,计算多酚含量。1.3.7平行试验结果除特殊说明外,所有指标均重复测定3次,结果为3次平行试验的平均值。采用SPSS19.0对数据统计分析,采用Duncan’s和LSD多重比较分析显著性(P<0.05)。2结果与分析2.1不同用量信息总体抗氧化物质的提取率从图1a可知,在超声时间40~60min之间,杨梅果实抗氧化物质提取率随时间的延长而不断提高,当超声时间60min时达到最高值,之后有所下降。从图1b可见,总抗氧化物提取率随着料液比的增加呈先上升后趋于平缓的变化规律,在料液比小于1∶30时萃取不完全,在料液比1∶30时萃取完全,即充分萃取后活性物质的提取率不再随着萃取溶剂的增加而增加。从图1c可见,当乙醇体积分数为60%~70%时,杨梅果实抗氧化物质浸提率高。当乙醇体积分数高于70%后,抗氧化物质的提取效率逐渐下降,这可能是由于随着乙醇体积分数的持续增加,脂溶性物质以及色素等其它成分的溶出量也会随之增加,与多酚类化合物竞争同乙醇-水分子结合2.2超声辅助提取抗氧化物质的回归模型利用Design-Expert软件对表2数据进行中心组合拟合,得到trolox物质的量对超声时间、料液比、酒精体积分数的回归模型:由表3方差分析所示,超声辅助提取抗氧化物质的模型极为显著(P=0.0033<0.01),表示回归模型指标高度显著;R在单因素试验的基础上,采用中心组合设计及响应面分析,建立超声时间、料液比、乙醇体积分数对杨梅果实抗氧化物质提取的回归模型,该回归模型R2.3干件的光照由图3a显示,杨梅果实提取物中抗氧化物质活性,无论在有光还是避光条件下均随时间的延长而呈下降趋势,且在有光照的条件下比同等无光条件下降得更快。由图3b显示,杨梅果实抗氧化物质稳定性受pH影响较大,在pH小于7时其比较稳定,即pH过高会影响多酚等抗氧化活性物质的稳定性2.4不同品种杨树莓抗氧化活性的研究选取杨梅果实颜色从紫红到白色的8个品种的杨梅,探究不同品种杨梅色泽、花色苷、多酚含量与总抗氧化活性的相关性。Pearson相关性分析(表5)显示,杨梅果实色泽亮度L3抗氧化活性物质的提取本研究利用超声辅助提取杨梅抗氧化活性物质,经响应面优化后确定了适宜的提取工艺参数为:超声时间54.94min、料液比1∶39.38(m∶V)、乙醇体积分数66.72%。在该条件下,杨梅浸提液中抗氧化活性物质含量(理论值)可达460.66μg/g(tro