鸡马立克氏病二价活疫苗cvi488+fc126株的培养

鸡马立克氏病二价活疫苗cvi488+fc126株的培养

鸡马拉斯病（md）是由马拉斯病病毒（mdv）引起的一种高度接触的革兰氏病。由MDVCVI988株和FC126株组成的双价冷冻活疫苗能够为鸡群提供良好的保护力1材料和方法1.1鸡碗SPF白来航鸡种蛋购自济南赛斯家禽科技有限责任公司,由本公司孵至9~10日龄。1.2种毒和病毒株1∶250活力胰蛋白酶、M199、DMSO、新生牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司;CVI988/Rispens株种毒和MDVⅠ型和Ⅲ型特异单克隆抗体由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室提供;HVTFC126株毒种购自中国兽医药品监察所;1层、5层、10层细胞工厂购自Corning公司;数控程序降温仪购自美国CBS公司;-80℃冰箱购自中科美菱低温冰箱技术有限公司。1.3方法1.3.1细胞密度的检测细胞制备:选择发育良好的9~10日龄SPF鸡胚,无菌取出胚体,去除头部、四肢和内脏,用PBS洗液洗涤胚体,按10mL/胚的胰酶量向收集瓶加入37℃预热0.125%胰酶,搅拌消化10min,静置片刻后将上清液过滤后得到消化液。重复消化一次,再次收集消化液后2500r/min离心8min。收集细胞泥加入适量的生长液吹打,用2层纱布滤过,配制成150万~200万/mL细胞密度的悬液,分装培养。形成细胞单层后待用。接毒及培养:细胞生长20~22h后,将细胞工厂和转瓶中的生长液弃去,将CVI988/Rispens株病毒按照7000~8000PFU/cm收获:将维持液弃去,用PBS液涮洗,加入0.125%胰酶消化,收集消化的细胞,2500r/min离心10min弃去上清液,细胞泥用冷冻保护液重悬,使细胞均匀分散,定量分装安瓿、封口。将分装的疫苗安瓿立即置程序降温仪,预冷至-70℃以下后移入液氮中保存。1.3.2病毒分别方法将CVI988株病毒分别采用10000~12000、7000~8000、5000~6000PFU/cm将FC126株病毒分别采用5000~6000、3000~4000、1000~2000PFU/cm1.3.3苗的比例对细胞工厂培养的达到收获标准的带毒细胞进行收获,全部按照0.007mL/cm1.3.4u3000坡压冻存方法按照正常程序收获分装疫苗,将疫苗安瓿立即分别置程序降温仪和-80℃冰箱中预冻,达到-70℃后,移入液氮中保存。-80℃冰箱冻存方法:将安瓿瓶置4℃保存30min,经过厚泡沫包裹后置-80℃冰箱保存8h再迅速放入液氮中保存。程序降温仪程序:将箱体预冻至4℃放入安瓶,预冻30min;以1℃/min的速率降至-4℃;以25℃/min的速率降至-40℃;以15℃/min的速率升至-12℃;以1℃/min的速率降至-40℃;以10℃/min的速率降至-90℃,移入液氮保存。2结果2.1胞工厂的细胞增殖状态细胞工厂与转瓶培养的比较结果见表1。由表1可见,相同密度的细胞接种后,细胞工厂中细胞增殖状态比转瓶好;同样的接毒剂量接入病毒液后,细胞工厂培养达到收获病变的时间较一致,收获的细胞病毒液毒价高,CVI988株病毒毒价提高45.8%~84.8%,FC126株病毒毒价提高33.8%~79.4%。2.2中毒剂量对毒价的影响CVI988株病毒按照7000~8000PFU/cmFC126株病毒最佳接毒剂量是1000~2000PFU/cm2.3效价、体积比例按照要求马立克氏病二价活疫苗疫苗CVI988株效价需达到2000PFU/羽份,FC126株达到1000PFU/羽份,3种体积比例较合适的是CVI988∶FC126为2∶1。2.4不同菌株在程序降温仪存件中的病毒毒价比较将CVI988病毒液与FC126株病毒液按照一定比例进行配苗分装后,采用不同的冷冻方式进行冷冻。3批疫苗安瓿瓶分装后使用-80℃冰箱冷冻和程序降温仪冷冻,结果差别明显,使用数控程序降温仪冻存获得疫苗效价与冰箱相比,CVI988株病毒毒价提高45.4%~101.5%,FC126株病毒毒价提高14.5%~83.6%。相比较低温冰箱,程序降温更可控、冷冻保存效果更高、批间差异小。3液氮程序降温仪的确定对比转瓶培养,使用细胞工厂生产鸡马立克氏病病毒能够达到收获时间稳定、病变均一、毒价水平高的效果。细胞工厂为静置培养,细胞贴壁良好,分布均匀。转瓶细胞贴壁时间较长,分布不完全均匀,因此容易导致细胞瓶间和批间差异大。在相同的培养面积下,细胞工厂占用空间是转瓶的26%。细胞工厂操作简便,节省人力,清洗方便,可重复使用多次,因此能够满足大规模生产需求。不同的接毒剂量对细胞病变的产生有直接影响,且由于增殖特性的差异按照相同收获比例收获的马立克氏病两种毒株病毒配合在一起,分别按照体积1∶1、2∶1和3∶1比例混合,但是通过免疫荧光检测方法测得的效价比例显示与体积比不相符合,这可能与不同马立克氏病病毒毒株同时接入鸡胚成纤维细胞上时存在相互竞争有关,FC126株病毒增殖快,在前期细胞增殖中占据优势,因此配苗时应降低其比例。最终确定的最适配苗比例是CVI988∶FC126=2∶1(v∶v)。疫苗在放入液氮前,需在-70~-90℃的环境中均匀冻结后再移入液氮保存。使用超低温冰箱冷冻时,由于冻结的速率不均匀会造成疫苗外层的冻结速度大于内层的冻结速度,增加了冰晶形成的可能,疫苗的失毒