面包中耐辐射菌种的分离鉴定及敏感性研究

面包中耐辐射菌种的分离鉴定及敏感性研究

面包是人们日常生活中最常见的食物。然而市售面包的货架期通常很短,这给面包的商业化流通带来一定的难度,对于军队、登山、探险、航海等特殊行业,就更需要一种储存时间长且品质有保证的主食面包。目前对于面包的保藏性研究多集中于添加防腐剂,调整水活和酸度等化学方法因此,本实验尝试利用射线辐照面包以延长保质期,并实现商业化流通的目标。面包储存时间过长,会出现发霉、发粘、牵丝的现象,面包上滋长的主要微生物有:青霉、曲霉、马铃薯杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等本研究采用划线分离方法和API菌种鉴定系统对辐照面包中主要微生物菌群进行分离和鉴定,得到辐照面包中的耐辐射菌种。同时,采用感染实验研究以面包为生长介质时不同浓度的两种耐辐射菌对辐照处理的敏感性。研究旨在为面包选择合适的辐照杀菌剂量,为进一步采取更加有效的复合措施抑制耐辐射菌种提供理论依据,进而大幅度延长面包的保质期,达到商业化流通的目的。1材料和方法1.1细菌鉴定系统面包制作原辅料,均为市售。常用设备与材料包括搅拌机、恒温恒湿箱、醒发箱、烤箱、封口机、超净工作台、恒温培养箱、漩涡振荡器、显微镜、接种针、2mL一次性注射器等。营养琼脂,革兰氏染色试剂,芽孢染色试剂,氧化酶试剂,触酶试剂,无菌生理盐水等。细菌鉴定系统采用法国bioMérieux公司API50CHB芽孢杆菌鉴定系统和APIStaph葡萄球菌和微球菌鉴定系统。使用法国bioMérieux公司APILabPlusV3.0和V4.0分析软件。中国农业科学院农产品加工研究所辐照中心提供辐照源1.2实验方法1.2.1发酵、515e的面团将面粉、酵母、糖、盐倒入搅拌机中,缓慢加水,低速搅拌4min,使混合均匀,成团,加入油脂,高速搅拌约15min至面筋完全形成。将面团置于温度为(30±2)℃,相对湿度为85%的醒发箱中发酵60min,翻面后发酵40min,取出,定量切割成(70±1)g重量的面团,搓圆,中间醒发15min。整型后置于(35±2)℃的醒发箱中醒发40min,取出后焙烤约16min至表面金黄,面火和底火均为210℃,出炉后室温冷却90min,铝箔袋热封包装。1.2.2辐射样品的采集和处理自制面包经1kGy辐照,37℃恒温培养箱放置1周,使之均匀长菌(使面包的带菌浓度约为101.2.3菌株划分及纯化从适当稀释度的平板上,挑取各菌种典型生长的单个菌落,然后在营养琼脂培养基上反复进行划线分离,根据菌落形态及染色镜检情况,连续划线培养至得到纯化的单菌落。1.2.4分析和利用有机碳质材料(1)芽孢杆菌的鉴定:革兰氏染色、芽孢形态、氧化酶、触酶试验参照《食品微生物检验手册》碳水化合物的利用:使用API50CHB芽孢杆菌鉴定系统,选用49种不同的碳水化合物为底物进行测定。分离的菌种经纯种扩大培养,制成一定浓度的菌悬液(浊度达到2McF),取该菌悬液0.2mL混入10mL的API50CHB培养基(No.50430,bioMérieux,France)中,再分别接种到49种不同的碳水化合物底物上,在30℃条件下培养48h,并分别在24h和48h时记录结果。结果通过软件APILabsoftwareV3.0(bioMérieux,France)进行分析,并与伯杰细菌鉴定手册(2)G碳水化合物的利用:使用APIStaph葡萄球菌和微球菌鉴定系统,选用20种不同的碳水化合物为底物进行测定。分离的菌种经纯种扩大培养,在APIStaph培养基中制成一定浓度的菌悬液(浊度达到0.5McF),再分别接种到20种不同的碳水化合物底物上,在37℃条件下培养24h,记录结果。结果通过软件APILabsoftwareV4.0(bioMérieux,France)进行分析,并与伯杰细菌鉴定手册1.2.5两种悬浮液的制备分别用无菌生理盐水洗下两种菌的菌苔,经漩涡振荡器充分混匀后,分别配制成高、低两个浓度(高浓度为101.2.6安全检测每个铝箔袋中装入自制面包一块(25±1)g,封口后用20kGy的剂量进行照射,随机取样进行检测,证明面包经20kGy的高剂量辐照后可以达到无菌状态。用2mL一次性注射器在每块无菌面包的多个位置上分多次注入1mL已配制好的菌悬液1.2.8计算方法的测试用平皿倾注稀释分离法进行计数1.2.9数据分析的方法应用Excel2003对数据进行统计分析。2结果与讨论2.1芽孢杆菌的分离培养通过划线分离得到一种纯菌种,经革兰氏染色后,在显微镜油镜下观察菌体的个体结构、菌落形态和生理生化特性,观察和实验结果见图1、2和表1。通过该菌株在显微镜下的菌体形态、染色情况,结合菌落特征及生理生化特征,可以初步鉴定为芽孢杆菌。如表2所示,初步鉴定的芽孢杆菌可以利用API50CHB试剂条中的甘油等26种碳水化合物,与枯草芽孢杆菌的模式菌株比较,对碳水化合物利用情况十分相似。经过APILabV3.0软件分析,辐照面包中分离纯化所得芽孢杆菌可鉴定为枯草芽孢杆菌,鉴定百分率为85.2%,评语为“好的鉴定”,枯草芽孢杆菌的相似度T为0.79,说明分离到的枯草芽孢杆菌与标准菌有很好的相似度。将分离和鉴定的菌株采用斜面培养基保存,作为下一步染菌实验的接种用菌。2.2个体结构、菌落形态和生理生化反应通过划线分离得到另一种纯菌种,经革兰氏染色后,在显微镜油镜下观察菌体的个体结构、菌落形态和生理生化反应,观察和实验结果见图3、4和表3。通过该菌株在显微镜下的菌体形态、染色情况,结合菌落特征及生理生化特征,可以初步鉴定为G由表4所示,初步鉴定的触酶阳性G辐照面包中分离得到的G2.3辐照处理对活菌计数的影响为进一步了解辐照处理对枯草芽孢杆菌和克氏微球菌的杀灭效果,将分离纯化所得两种耐辐射菌种在面包上做感染实验,再以不同剂量进行辐照,然后分别对活菌计数,得出各菌的杀菌曲线以考察其对辐照处理的敏感性。由图5、6可明显地看出,辐照处理对面包具有很好的杀菌效果,3kGy的辐照剂量就可以使两种耐辐射菌的菌数减少3～4个对数值,同时随着辐照剂量的增加,灭菌效果越好,辐照剂量与存活菌数呈现明显的线性关系,检测结果经线性拟合,可得出面包中两种耐辐射菌的辐照剂量与存活菌数的直线回归方程。微生物对射线的敏感性常用D3辐照面包的微生物发酵本研究通过划线分离方法和API菌种鉴定系统对辐照面包中主要微生物菌群进行分离和鉴定,得出枯草芽孢杆菌和克氏微球菌是辐照面包上的最耐辐照菌种。辐照面包中,