mek抑制剂曲美替尼在v-ki-ras2kirsen大鼠结直肠癌细胞中耐药机制的研究

mek抑制剂曲美替尼在v-ki-ras2kirsen大鼠结直肠癌细胞中耐药机制的研究

人类1.3的癌症与ras变异有关。1材料和方法1.1细胞培养和给药K-RAS基因突变型CRC细胞株LS174T(G12D）、DLD-1(G13D）、HCT116(G13D）均购自上海细胞库。MEK抑制剂Trametinib(M8697-10UG）、JAK2/STAT3抑制剂鲁索替尼（Ruxolitinib,SAB4300123）或LY5(GW21465）均购自美国Sigma-Aldrich公司，临用前使用RPMI1640培养液稀释到终浓度。RPMI1640培养基（61870044）、胎牛血清（FBS,12662011）均购自美国GibcoBRL公司；p-STAT3(Y70562214）、STAT3(KHO0481）、p-ERK1/2(KHO058）、GAPDH抗体（EPR16891）均购自美国CellSignaling公司。DMSO(DZ0231）购自AMRESCO公司。1.2基因的培养和代代相传将LS174T、DLD-1、HCT116细胞株置于含10%FBS的RPMI1640培养液中，在5%CO1.3细胞蛋白分析采用Westernblot法。用Trametinib(1、5、10μM浓度）处理LS174T、DLD-1、HCT116细胞，检测其STAT3上游蛋白JAK2、JAK3、Src等是否激活。预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3遍，蛋白裂解液提取细胞核和细胞质蛋白；然后进行蛋白浓度测定，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质样品，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，电泳。免疫反应：封闭，孵育一抗，洗涤，孵育二抗，洗涤；应用化学发光成像系统对信号进行评价。实验重复3次。1.4hct116细胞p-stat3采用Westernblot法。分别用Trametinib(5μM）、Ruxolitinib(2.5μM）/LY5(1μM）或Trametinib(5μM)+Ruxolitinib(2.5μM）/LY5(1μM）处理HCT116细胞24h，检测其p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表达。实验步骤同1.3，重复3次。1.5hct116细胞的生长采用磺酰罗丹明B蛋白染色实验。分别用Trametinib(5μM）、LY5(1μM）或Trametinib(5μM)+LY5(1μM）处理HCT116细胞24h，去上清液，按细胞密度1000个/孔接种于60mm孔盘中，再用新鲜的培养基培养2周。10%冷的三氯乙酸固定细胞，4℃放置1h，反复用蒸馏水洗，待自然干燥。每孔加入冰醋酸配制的磺酰罗丹明B溶液100μl，室温下染色15min，流水缓慢洗去染液，空气下自然干燥。在100倍显微镜下观察。以DMSO为参照，计算细胞增殖率。实验重复3次。1.6hct1106和ld-1的细胞移动率采用细胞迁移划痕实验。先用记号笔在6孔板上均匀地划横线，然后按细胞密度1×101.7hct116、dld-1细胞生存率检测采用MTT实验。分别用Trametinib(1或5μM）、LY5(0.5或1μM）、Trametinib(1或5μM)+LY5(0.5或1μM）处理HCT-116、DLD-1细胞；无药物处理、常规培养的HCT-116、DLD-1细胞作为阴性对照。在37°C、5%CO1.8统计处理应用SPSS19.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2结果2.1traminib对k-ras突变crc细胞中stat3的激活作用在HCT116、LS174T和DLD-1细胞中，Trametinib可明显抑制ERK1/2的磷酸化，同时诱导p-STAT32.2hct1106细胞的p-stat3在HCT116细胞中，Trametinib+Ruxolitinib/LY5可同时阻断p-STAT32.3各组细胞增殖率比较Trametinib、LY5、Trametinib+LY5组细胞增殖率分别为62.11%、31.30%和9.95%，差异有统计学意义（P<0.05），其中Trametinib+LY5组明显低于单药组（均P<0.05），见图3。2.4胞迁移率比较在HCT116细胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5组细胞迁移率分别为69.8%、52.8%、7.2%，差异有统计学意义（P<0.05）；在DLD-1细胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5组细胞迁移率分别为66.0%、62.0%、4.0%，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。2.5各组细胞生存率比较在HCT116、DLD-1细胞中，Trametinib+LY5组细胞生存率明显低于单药组，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表1～2。3k-ras基因突变型crc治疗crc的临床研究到目前为止，化疗和靶向药物治疗是晚期CRC的主要治疗方法。靶向治疗CRC的EGFR单克隆抗体主要为帕尼单抗、西妥昔单抗，与内源性配体竞争性抑制EGFR转导，从而发挥抗肿瘤作用。有研究证明EGFR单克隆抗体对K-RAS基因突变型CRC患者无效K-RAS抑制剂作用于RAS/Raf/MEK/ERK细胞信号传导通路上游基因，其成功开发进一步促进了对K-RAS基因突变的CRC治疗研究。30多年来，科学家们认识到RAS编码蛋白的基因突变是最强大的癌症驱动因素之一鉴于MEK抑制剂Trametinib在临床治疗转移性黑色素瘤和不能手术治疗的黑色素瘤患者的优势，科学家提出采用K-RAS下游ME