第一部分微生物的利用

第一部分微生物的利用第一部分微生物的利用第1页本专题在模块中地位和作用1、《生物技术实践模块》突出课程基础性、实践性、技术性和时代性。2、本专题突出微生物培养技术在生物技术中地位：操作基础（从古至今历史悠久，难度不大，是基础试验研究）理论基础（为其它试验技术发展提供理论依据）研究材料基础（微生物取材轻易，分布广泛，是表达其它生物技术很好试验材料）3、详细活动内容微生物培养技术（培养、分离、技术应用）技术是基础相同，但可供选择微生物物种含有多样性。第一部分微生物的利用第2页试验1大肠杆菌培养和分离详细内容标准活动提议进行微生物分离和培养。用大肠杆菌为材料进行平面培养，分离菌落。一、课程标准对于本试验要求第一部分微生物的利用第3页二、课程试验内容安排及思索试验1大肠杆菌培养和分离（一）内容安排1.表达以微生物（如大肠杆菌）培养为关键微生物试验操作技术

2.表达生物学原理应用（新陈代谢、遗传等）第一部分微生物的利用第4页试验1大肠杆菌培养和分离（二）教材中试验内容安排1．配制培养基标准、方法，无菌操作要求，灭菌相关技术，微生物分离原理和微生物培养条件。2．进行大肠杆菌扩增，用液体培养基操作细菌培养。3．进行大肠杆菌分离，用固定平面培养基进行细菌划线培养。二、课程试验内容安排及思索第一部分微生物的利用第5页试验1大肠杆菌培养和分离配置培养基、灭菌（课前提前准备）微生物培养相关知识，（操作、基础原理、培养基配制标准，如划线分离法等）（一课时或布置学生自学）完成培养基倒平板操作和接种（一课时）试验结果讨论（时间机动）（三）老师整体教学规划提议

第一部分微生物的利用第6页三、试验教学详细技术操作问题试验1大肠杆菌培养和分离（一）需提前准备试验材料、仪器和试剂

1．灭菌锅或高压锅2．250mL三角瓶、封口膜和橡皮圈3．直径9cm培养皿4．接种环和玻璃三角刮刀5．恒温培养箱6．摇床7．酒精灯和超净台8．一次性塑料手套第一部分微生物的利用第7页试验1大肠杆菌培养和分离9．装有酒精棉球广口瓶10．镊子11．有棉塞试管（1.5×12cm）5支12．LB液体培养基13．大肠杆菌菌种斜面14．空白斜面15．电子天平、称量纸、移液器注意：大肠杆菌菌种斜面、空白斜面均为LB固体培养基，与LB液体培养基相比，在斜面制作过程中添加了琼脂作为凝固剂。

三、试验教学详细技术操作问题第一部分微生物的利用第8页（二）关键技术原理——“细菌划线分离法”赵金秋（西城教研）摄第一部分微生物的利用第9页试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程分别分装配制好LB液体、固体培养基灭菌（培养基、试验所用器具等，培养皿、试管用牛皮纸或报纸包好，放入灭菌锅）1000g/cm2压力下，121℃灭菌15min，如使用高压锅，需在有压力后灭菌15min。第一部分微生物的利用第10页试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程消毒：待高压锅或灭菌锅中压力与大气压相同时打开锅盖，将已灭菌物品放至超净工作台上，并打开紫外灯和过滤风开关。注意：打开紫外灯后，人必须离开，以免身体受到伤害。第一部分微生物的利用第11页试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程倒平板：待三角瓶中LB固体培养基冷到60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子从广口瓶中夹出酒精棉球擦试桌面和手。注意：一定要在擦试手之前点燃酒精灯，以免发生危险。在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基三角瓶封口膜，右手其它三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖一边，将三角瓶中培养基倒在培养皿里。注意一定不要把培养基沾在培养皿壁上，以免污染。第一部分微生物的利用第12页试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程将大肠杆菌接种在LB液体培养基中,然后将三角瓶放在恒温摇床培养箱中振荡培养12h，温度控制在37℃左右。进行扩充培养,增加大肠杆菌数量。赵金秋（西城教研）摄第一部分微生物的利用第13页划线分离：将摇床上培养12h三角瓶打开，接种环个别深入到菌液中。然后，在装有固体培养基每个培养皿平板上连续划线。划线后盖好培养皿。消除污染杂菌通用方法，也是用于筛选高表示量菌株最简便方法之一。

试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程第一部分微生物的利用第14页培养：将培养皿均需倒置摆放到37℃恒温培养箱中培养12～24h，恒温培养时，培养基中水分会以水蒸气形式蒸发，并凝结成水滴留在培养皿盖上；不然水蒸气形成水滴会落入培养基表面而且扩散开。假如培养皿中已形成菌落，则菌落中菌会随水扩散，菌落间相互影响，极难再分成单菌落，达不到分离目标。试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程第一部分微生物的利用第15页试验结果：

培养皿LB固体培养基中可看到在划线末端位置出现不连续单个菌落，表明大肠杆菌已被分离。

菌种保留：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再划线接种在空白斜面上，37℃培养24h后，4℃冰箱保留。试验1大肠杆菌培养和分离（三）试验流程第一部分微生物的利用第16页试验1大肠杆菌培养和分离第一部分微生物的利用第17页详细内容标准活动提议测定某种微生物数量研究培养基对微生物选择作用用土壤浸出液进行细菌培养，仅以尿素为氮源，测定能生长细菌数量一、课程标准对于本试验要求试验2分离以尿素为氮源微生物

第一部分微生物的利用第18页试验2分离以尿素为氮源微生物（一）内容安排1.表达以微生物选择培养与计数为关键微生物试验操作技术

2.表达生物学原理应用二、课程试验内容安排及思索第一部分微生物的利用第19页试验2分离以尿素为氮源微生物（二）教材中试验内容安排1．使用专一培养基（含有尿素）分离专一细菌（有脲酶细菌）2．使用指示剂颜色改变检知酶（脲酶）所催化反应3．说明测定细菌数量原理与方法二、课程试验内容安排及思索第一部分微生物的利用第20页试验2分离以尿素为氮源微生物培养基配制和灭菌操作微生物培养相关知识（或布置学生自学）：如选择培养基、涂布分离法等。设计试验方案。菌液制备、涂布分离、微生物培养（学生操作）（三）整体教学规划提议第一部分微生物的利用第21页三、试验教学详细技术操作问题

试验2分离以尿素为氮源微生物（一）需提前准备试验材料、仪器和试剂1.设备及用具①250mL三角瓶1个和100mL三角瓶2个②有盖试管3支（1.5×15cm）和试管架③培养皿4个④超净台⑤移液器⑥玻璃刮刀⑦酒精灯⑧200mL烧杯1个第一部分微生物的利用第22页试验2分离以尿素为氮源微生物（一）需提前准备试验材料、仪器和试剂2.材料①50mL70%乙醇②100mL三角瓶中配制好25mL全营养LB固体培养基，加上封口膜后灭菌待用③100mL三角瓶中配制好25mL尿素固体培养基，加上封口膜后灭菌，待冷至60℃时，加入经过G6玻璃漏斗过滤（使之无菌）后10mL尿素溶液，摇动混合均匀后待用④3支有盖试管中均加入4.5mL蒸馏水后灭菌待用⑤250mL三角瓶加入99mL蒸馏水，加封口膜后灭菌待用⑥土样1g（在有哺乳动物排泄物地方取得）。三、试验教学详细技术操作问题第一部分微生物的利用第23页（二）试验流程——基础原理

试验2分离以尿素为氮源微生物（1）琼脂和琼脂糖琼脂是一个未被纯化混合物，主要成份为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少许含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺乏组成成份，其优点是：①其主要成份不能被微生物利用；②可使培养基固化；③不影响培养基中其它营养物质被细菌吸收。第一部分微生物的利用第24页本试验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基固化剂，其目标是：尽可能使培养基中只含尿素一个含氮化合物，以预防琼脂中含氮化合物被以尿素为氮源细菌利用，有利于对这类细菌筛选。（2）酸碱指示剂尿素在被脲酶催化分解前是中性，因为尿素在脲酶催化下分解产生了NH3，溶液会呈碱性。（二）试验流程——基础原理试验2分离以尿素为氮源微生物第一部分微生物的利用第25页酸碱指示剂是用来指示化学反应前后溶液酸碱性改变。本试验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.4～8.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色，（二）试验流程——基础原理试验2分离以尿素为氮源微生物第一部分微生物的利用第26页试验2分离以尿素为氮源微生物以尿素为氮源微生物培养一段时间后，因为细菌产生脲酶向周围扩散，将培养基中分解，产生NH3使培养基pH由原来中性变为碱性，于是培养基中酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素能力愈强。（二）试验流程——基础原理第一部分微生物的利用第27页

涂布分离时，需要先将菌液稀释，普通稀释到10-5～10-7之间，然后取0.1mL不一样稀释度菌液，放在培养皿固体培养基上，再用消毒后玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平面，在适当稀释度下，可培养产生相互分开

菌落。通常每个培养皿中有20个以内单菌落为最适当。将每个菌落分别接种在斜面上扩充培养后，再做功效性试验。

（二）试验流程

关键技术——“涂布分离法”试验2分离以尿素为氮源微生物第一部分微生物的利用第28页（1）制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌全营养LB固体培养基和尿素固体培养基，放在超净工作台上，冷却至60℃左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至2个培养皿中（做两组，共4个空白平板），轻轻摇匀，平放至凝固。试验2分离以尿素为氮源微生物（二）试验流程——基础操作步骤第一部分微生物的利用第29页（2）制备细菌悬液：在无菌条件下，在将1g土样加到装有99mL无菌水三角瓶中，振荡10min，即成10－2土壤稀释液，并依次制备出10－3～10－7稀释液。比如，若想制备10-6稀释液，可取0.5mL10-5稀释液。取样时，尽可能只取悬液，倒入有4.5mL无菌水有盖试管中，摇匀，放在试管架上。试验2分离以尿素为氮源微生物（二）试验流程——基础操作步骤第一部分微生物的利用第30页

（3）涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取0.1mL稀释度为10-4和10-5土壤稀释液（细菌悬液），分别加到装有全营养LB培养基和尿素培养基培养皿（空白平板）中；再将保留在70%酒精中玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。

试验2分离以尿素为氮源微生物（二）试验流程——基础操作步骤第一部分微生物的利用第31页（4）将培养皿倒置摆放在37℃恒温箱中培养24～48h，观察菌落数。试验2分离以尿素为氮源微生物（二）试验流程——基础操作步骤第一部分微生物的利用第32页试验2分离以尿素为氮源微生物第一部分微生物的利用第33页观察试验结果与稀释度为10-5相比，LB培养基中菌落数在10-4处理中

，尿素培养基中菌落数在10-4处理中

。在相同稀释度情况下，尿素培养基中菌落数

于LB培养基中菌落数，其原因是：

。试验2分离以尿素为氮源微生物（二）试验流程——基础操作步骤第一部分微生物的利用第34页试验3观察土壤中能分解纤维素微生物

详细内容标准活动提议探讨微生物利用观察并分离土壤中能分解纤维素微生物。观察该微生物能否分解其它物质，讨论这类微生物应用价值。一、课程标准对于本试验要求第一部分微生物的利用第35页（一）内容安排1.尝试微生物选择培养操作技术

2.表达微生物选择培养在筛选菌种中应用试验3观察土壤中能分解纤维素微生物

二、课程试验内容安排及思索第一部分微生物的利用第36页试验3观察土壤中能分解纤维素微生物（二）教材中试验内容安排1．说出纤维素酶作用，简述纤维素酶应用价值。2．说明培养基对微生物选择作用。3．分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶菌株，观察、统计其对纤维素分解作用。4．体验能水解纤维素微生物在环境保护中意义。

二、课程试验内容安排及思索第一部分微生物的利用第37页（一）需提前准备试验材料、仪器和试剂1．灭菌锅或高压锅2．直径9cm或12cm培养皿、250mL三角瓶3．自制保湿小室：有盖小玻璃缸（如鱼缸），内加入少许水即可4．80g草炭土或枯树周围土5．牛皮纸（90cm2）2张、卷烟纸6张三、试验教学详细技术操作问题试验3观察土壤中能分解纤维素微生物第一部分微生物的利用第38页试验3观察土壤中能分解纤维素微生物（二）试验流程——基础原理(1)纤维素酶及其作用植物细胞壁中主要化学成有纤维素、半纤维素、果胶、木质素、蛋白质、水和外壳物质，其中纤维素是地球上最丰富有机物质。在枯树或草炭土中有许多利用和分解这些物质作为能源微生物，它们可分泌纤维素，酶促分解纤维素，常见产生纤维素酶微生物有绿色木霉、变异青霉、黑曲霉和根霉等。纤维素酶是一类酶总称，可催化水解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖。纤维素酶包含酶C1酶、Cx酶和β－葡萄糖苷酶

第一部分微生物的利用第39页(2)选择培养基对微生物选择作用选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制大家不需要微生物生长，促进大家需要微生物生长。本试验目标是分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶菌株，纤维素是这类微生物可利用碳源和能源。因为卷烟纸普通只含纤维素而不含其它物质，所以，只有能分泌纤维素酶并以纤维素为碳源和能源微生物才能生长在卷烟纸上。

试验3观察土壤中能分解纤维素微生物（二）试验流程——基础原理第一部分微生物的利用第40页(3)用“滤纸瓦解法”测定纤维素酶活性一定大小滤纸在纤维素酶作用下，滤纸逐步被破坏，以滤纸破坏速度表示酶活性大小，即滤纸破坏速度越快，纤维素酶活性越大。

试验3观察土壤中能分解纤维素微生物（二）试验流程——基础原理第一部分微生物的利用第41页试验3观察土壤中能分解纤维素微生物