细胞工程植物种质保存

二、种质保留意义

伴随经济发展，地球不停开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包含栽培种、野生种甚至杂草，都含有各自独特优良基因，是植物品种改良乃至农业可连续发展基础。它们是经过长久进化而来，一旦失去不会再来。所以，世界各国都很重视植物种质资源搜集与保留研究。

细胞工程植物种质保存第1页三、种质保留方法

按保留地理位置分为原地保留和异地保留。原地保留是在原来生态环境条件下,就地保留,自我繁殖品种资源,普通野生品种资源采取这种方式保留,如建立自然保护区,天然公园等；异地保留是将种子或植株保留于该品种资源原产地以外地域,这种保留可采取植物园、种质园、种质库等形式或采取试管保留形式。

按照保留详细方法,品种资源保留可分为种植保留、贮藏保留、试管保留、基因文库保留。

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1、种植保留

为了保持品种资源种子或无性繁殖器官生活力,并不停补充其数量,品种资源材抖须每隔一定时间播种一次,即种植保留。

在种植保留时,种植条件尽可能与原产地相同,以降低因为生态条件改变而引发变异和自然选择影响。在种植过程中应尽可能防止或降低天然杂交和人为混杂。播种和收获时取样要有代表性以免因抽样而造成遗传漂移。总之要尽可能地保持原品种或类型遗传特点和群体结构。另外,对来自自然条件悬殊地域品种资源,可分别在不一样生态地点异地种植保留。

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2、贮藏保留

贮藏保留就是用控制贮藏条件(主要是温度和湿度)方法,来保持品种资源种子生活力。

长久贮藏保留种子生活力技术关键是低温和干燥,经过控制种子周围环境中温湿度,迫使种子处于代谢作用最低程度。

贮藏保留种质资源采取种质库,种质库分三种：长久库、中期库和短期库。

细胞工程植物种质保存第5页细胞工程植物种质保存第6页3、基因文库保留

利用DNA重组技术，将种质材料总DNA或染色体全部片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，经过细胞增殖，组成各个DNA片断克隆系。

细胞工程植物种质保存第7页细胞工程植物种质保存第8页第二节试管保留

一、常温下试管保留

可利用试管苗继代培养保留，但需要经常更换培养基。

细胞工程植物种质保存第9页二、常温抑制生长保留

为了延缓继代时间，可在培养基中添加长抑制剂或提升渗透压等。如脱落酸(ABA)、矮壮素（2-氯乙基三甲基氯化按，简称CCC）、二甲氨基琥珀酸酰胺（简称B9）、多效唑（PP333）等都是生长抑制物质，培养基中添加一定量能够延缓生长。普通情况下几个月继代一次，而添加这些物质后，可到达一年甚至以上。

提升培养基渗透压也能够延缓生长。可用蔗糖或甘露醇，浓度分别调到10%左右和4%—6%。

细胞工程植物种质保存第10页三、中低温调控生长保留

在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。普通植物可调到1—9℃，热带、亚热带植物调至10—20℃。

细胞工程植物种质保存第11页四、常温抑制生长保留与中低温调控生长保留相结合

培养基中添加生长抑制剂或提升渗透压，培养温度降低，使继代时间延长。

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第三节超低温保留Cryopreservation

一、超低温保留基本原理和主要步骤

在液氮中（-196℃），几乎全部细胞代谢活动停顿，仅保留细胞活力和形态发生潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。

超低温保留比较复杂，哪一步操作不妥，都会使细胞受伤害，失去再生能力。

注：超低温通常指低于一

80℃低温，保留介质或容器有干冰(一79℃)、超低温冰箱(-80-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸气相(-140℃)等，其中液氮最惯用。细胞工程植物种质保存第13页细胞工程植物种质保存第14页二、超低温保留技术

1、保留材料选择

2、冷冻前材料预处理

3、添加冷冻防护剂

4、材料冷冻方法（预冷）

5、材料保留

6、保留材料解冻

7、保留材料复苏培养

细胞工程植物种质保存第15页1、保留材料选择

花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均能够作为保留材料。

细胞工程植物种质保存第16页2、冷冻前材料预处理

为了使保留材料适应超低温条件，必须进行预处理。

预处理方法：将保留材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸，在靠近零度下培养数日。

细胞工程植物种质保存第17页3、添加冷冻防护剂

为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂。惯用冷冻防护剂有：二甲基亚砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、二甘醇、乙酰胺、福美氧化硫等。

细胞工程植物种质保存第18页4、材料冷冻方法

材料冷冻保留原理：冷冻时，细胞外溶液水分子，先形成冰晶中心，而冰晶形成速度与溶液成份、降温速度相关。普通在-20℃—-60℃范围内，晶体中心增加最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到-140℃时完全停顿增加。

细胞工程植物种质保存第19页4、冷冻处理

（1）快速冷冻

将植物材料从0℃

或者其它预处理温度直接投入液氮中保留方法。降温速度为1000℃/min。植物体内水分在降温冷冻过程中，从-10℃—-140℃范围内是冰晶形成和增加危险温度区，到-140℃时完全停顿增加，关键是利用高速降温越过冰晶增加危险温度区，不能形成致死冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。

细胞工程植物种质保存第20页（2）慢速冷冻法

将植物材料从0℃

或者其它预处理温度以降温速度为1~2℃/min从起始温度降到-100℃，稳定1h后投入液氮中保留或以此降温速度降至-196℃。

在这种降温速度下，细胞内水分有充分时间不停渗透到细胞外结冰，使细胞内水分降低到最底程度，防止细胞内结冰细胞工程植物种质保存第21页（3）预冷冻法

投入液氮前，需经过短暂时间低温锻炼方法

①两步冷冻：慢速冷冻至-40℃，停留一段时间，快速冷冻。

②逐层冷冻：材料经过不一样温度等级降温至-40℃，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。

细胞工程植物种质保存第22页（4）干燥冷冻

将材料置于27~29℃烘箱内降低植物含水量，在投入液氮中保留。此法能够预防材料冻死。细胞工程植物种质保存第23页5、材料保留

-196℃液氮冰箱中或液氮罐中保留。

6、保留材料解冻

解冻速度是解冻技术关键，普通在37℃热水浴中解冻。

解冻速度慢，细胞内轻易发生再结晶，而造成细胞死亡。

解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。

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细胞工程植物种质保存第24页（1）快速解冻法

保留材料直接投入到37~40℃水浴中进行解冻方法。-50~-10℃是再结冰温度区

（2）慢速解冻

先置于0℃解冻，在逐步升温至室温。能够使水分慢慢渗透细胞内。细胞工程植物种质保存第25页7、保留材料复苏培养