x-射线结晶学研究新进展

x-射线结晶学研究新进展

结构因素群或结构蛋白质群可定义为寻求特定结构的三维结构，并获得所有蛋白质的三维结构。随着自动化大分子结构测定的发展,结构生物学研究进入了一个新时期。在蛋白质表达、纯化、微结晶(micro-crystallization)自动化取得重大进展的基础上,一体化的同步辐射光线束(integratedsynchrotronradiationbeamline)高聚焦1yhistidie和谷胱甘肽-s-转移酶结构基因组学的一个重要方面是使用亲和层析使重组蛋白质的纯化自动化。将大量的蛋白质与亲和靶(affinity-tag)连接,这些靶包括多聚组氨酸(polyhistidine)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase)。同时,将靶挂到重组蛋白质的N-末端或C-末端也是非常重要的,然后,检测连接了不同靶的重组蛋白质的可溶性表达和结构。现在的战略是选择一种亲和层析靶,在有这种靶的条件下,研究重组蛋白质的性质。其余的蛋白质可以用不同的亲和层析来纯化。到目前为止,多聚组氨酸接头已经被证明是最普遍、最有效的靶。目前,需要做对照实验来证明是否在进行晶体衍射研究之前,应该将靶去掉2利用大肠杆菌作为表达系统Edwards等研究了1000多个蛋白质结构基因组学研究将充分利用大肠杆菌作为表达系统,因为大肠杆菌很容易操作、成本低、适合表达载体。用硒-甲硫氨酸(seleno-methionine)可以代谢标记用于结晶研究的蛋白质,用3晶体衍射研究中的自动化技术结构基因组学研究需要纯化成千上万个蛋白质和蛋白质片段,用现在的研究方法不能达到这个目的。因此,结构基因组学是否成功取决于蛋白质纯化方法的自动化、半自动化、机械化和容易的方法。做晶体衍射研究的蛋白质需要其高表达,亲和层析是主要的纯化方法。对晶体衍射研究而言,需要去掉接头和额外的纯化步骤,更大的纯度可以增加晶体生长和再生的可能性。晶体衍射主要的问题是要从蛋白质样品中去掉杂蛋白酶。从细菌提取物中纯化蛋白质完全自动化是较困难的,特别是细菌收集、裂解细菌、制备粗提液等步骤。由于大体积、高粘度、离心和过滤过程非常具有挑战性,所以,需要新的自动化技术,在这些新技术开发出来之前,研究人员将用手工操作细菌收获和裂解步骤,其余的步骤为半自动化过程。到目前为止,用于结构基因组学研究的大蛋白质和复杂蛋白质样品的生产还没有建立起来,一种方法可能是普通结构基因组学研究方法的规模化,在适当的表达寄主中生产蛋白质,然后进行纯化和结构测定。从历史上看,这些方法成功率低,因为复杂蛋白质包含几个结构域(structuraldomain),表达、纯化和结晶较困难。4控制内部控制结构基因组学的目的是以最有效的方法测定蛋白质的结构,注意质量控制可以增加效率。最有效的方法是使用生物化学方法来估计结构测定的实用性,真核生物基因产品的蛋白质表达和溶解性水平低,这是在大肠杆菌表达系统中进行重组蛋白质生产的瓶颈,Folkers等5浓度结晶实验在成功地制备了高纯度和溶解的蛋白质样品以后,正常的结晶过程就开始了。将蛋白质样品缓慢移动到亚稳的超饱和状态(meta-stablesupersaturatedstate),实际的结晶条件不能从头开始决定,标准方法是优化几个溶液变量,如pH值、离子强度、温度、有机添加剂的特殊浓度、盐的浓度和洗涤剂的浓度结晶过程的自动化是第8次国际生物大分子结晶会议(the8thInternationalConferenceonCrystallizationofBiologicalMacromolecules,ICCBM8)的一个焦点。在美国的Hauptman-Woodward医学研究所、德国的蛋白质结构工厂、美国的LawrenceBerkeley国家实验室生物实验仪器研究小组、Novartis研究基金会的结构基因组学研究所和Syrrx公司已经开发出新一代机器人能够自动化生产高质量的蛋白质晶体,1d能从事10000到100000次实验。另外,成功和失败的数据可以精确地收集起来用于数据挖掘和分析、进一步改进实验。Hauptman-Woodward和Synrrx开发的研究系统通过把实验微型化到mμL体积的水平,减少了对蛋白质的需求。虽然最近的几个进展显示这一过程是高通量的方式(high-throughputmanner),但是对这些样品分析仍然是一个挑战6快速、有效的收集一旦获得晶体,必须被收集起来用于数据收集,在大多数情况下,结构基因组学研究将依靠同步辐射设备对衍射数据进行快速、有效的收集。所以,样品必须被包埋和储存起来。在大分子结晶学同步加速器数据收集(synchrotrondatacollection)方面的一个突破一直是蛋白质晶体的常规冷冻(routinefreezing)从多孔板(multi-wellplate)收集晶体是对7同步加速器使用时间短开始时,同步加速器线束是作为实验站而开发的,目的不是用于高流量数据收集,所以,现在的数据收集实验需要使用者进入线束箱固定和定位晶体,然后再退出和锁上线束箱,每一个晶体都需要这样操作。这些任务造成了昂贵和稀有的同步加速器使用时间的巨大浪费。由于已经开发出可靠的同步加速器源(synchrotronsources)、稳定的8syrrx和lbnl的生物协作研究小组的研究计划Abbott实验室的SteveMuchmore介绍了一种操作系统,该系统可以在标准实验室旋转阳极为基础的系统中不断地收集多个数据,这是由于他们使用了自动化样品变换器和排列系统的原因。这个系统由三轴操作自动机器(three-axismanipulationrobot)组成,可以用于固定晶体和照相,包括一个样品储存架可以将63个预先冷冻的晶体固定在冷冻环上。这个架子保存在一个开放的杜瓦瓶中,使用液氮来降低温度。第2个系统是开发专门用于同步加速器的光线束,Syrrx和LBNL的生物协作研究小组正在开发第一代用于同步加速器线束的自动晶体识别和排列系统,这个系统把一个标准的冷冻小玻璃瓶(cryovial)移到测角器(goniometer),当这个小玻璃瓶移动到杜瓦瓶中时,用电磁铁容纳磁帽和样品。再使用计算机软件可以1d处理几百个晶体的数据收集和筛选。最近设计的GrenobleEMBL/ESRF微晶体衍射计可以检测非常小的晶体,这种系统使用最大限度的精确定位和最方便的操作方法可以检测小到5μm的晶体9蛋白质结构检测大多数结构检测需要筛选多个晶体,目的是选择最合适的衍射质量和取向的样品。例如,突变蛋白质和有抑制剂的蛋白质的结构检测需要