仙人掌超氧化物歧化酶提取纯化工艺研究

仙人掌超氧化物歧化酶提取纯化工艺研究

美国佳伦塔杏仁（ourma）出生于墨西哥。1997年，农业部成功引进中国。它在中国20多年里广泛种植，成为消费者喜爱的蔬菜。米邦塔仙人掌营养丰富，富含蛋白质、维生素、氨基酸、矿物质、不饱和脂肪酸等营养成分以仙人掌为原料，以蓝莓、灵芝、西瓜、猕猴桃等作为复配原料，开发出的复合饮料和发酵乳制品报道较多试验以仙人掌为原料，提取和部分纯化SOD，以黄瓜作为复配材料制备仙人掌SOD功能饮料，为仙人掌资源的深加工提供参考。1材料和方法1.1实验试剂及试剂米邦塔仙人掌（周口扶沟种植园）；黄瓜（毛庄菜市场）；蔗糖（食用级，西糖业有限公司）；乙酸锌（食用级，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙基麦芽酚（食用级，青岛花帝食品配料有限公司）；Sephadex(G-75,AmershamPharmacia）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）；联苯三酚（分析纯，贵州遵义市建强化工有限公司）；聚乙二醇（分析纯，派尼市化学试剂厂）；其他试剂均为分析纯。1.2仪器、仪器和检测方法组织捣碎匀浆机（JJ-2，金坛市亿通电子有限公司）；高速冷冻离心机（GL-22M，赛特湘仪离心机仪器有限公司）；酸度计（HI253台式，上海泸西分析仪器厂有限公司）；自动部分收集器（BSZ-100，上海泸西分析仪器厂有限公司）；紫外分光光度计（UV-2100，上海泸西分析仪器厂有限公司）。1.3方法1.3.1磷酸缓冲液的制备称200g仙人掌用蒸馏水洗净，切成3cm×2cm的块，加入18mLpH7.80.05mol/L的磷酸缓冲液。匀浆、过滤，滤液在4℃下，以8000r/min离心10min。收集上清液460mL，加入960mL冷丙酮，放入4℃冰箱中过夜。收集沉淀，加入95mL磷酸缓冲液溶解，总体积108mL。离心除去不溶物质，收集上清液100mL。仙人掌SOD的提取工艺流程：1.3.2蛋白质浓度的测定按照参考文献1.3.3酶活力的测定在pH8.2、25℃条件下，1mL的反应液中1min联苯三酚在325nm波长处的自氧化速率达50%时的酶量定义为1个活力单位。按照文献1.3.4蛋白质浓度、酶活浓度的测定收集的上清液中加入9.54g固体硫酸铵至饱和度20%,4℃冰箱中放置2～3h。高速离心机离心10min、10000r/min，收集上清液80mL。再测蛋白质浓度、酶活。添加固体硫酸铵37.52g至饱和度90%。放入4℃冰箱过夜。以12000r/min转速离心40min，收集沉淀。加入8mL磷酸缓冲液溶解即为酶液。测蛋白质浓度、酶活。1.3.5透析、搅拌将酶液移入处理好的透析袋中，在磷酸缓冲液中，4℃下透析过夜，不时搅拌。将透析完毕的透析袋，用聚乙二醇覆盖脱水，待袋内溶液体积浓缩到10mL左右，取出即为浓缩酶液。1.3.6聚乙二醇反渗透凝胶经预处理，装柱，平衡，将10mL浓缩酶液一次性装入事先处理好的SephadexG-75柱。用磷酸缓冲液洗脱，用自动收集器收集，调整流速，每10min自动收集一管，每管约5～6mL。每隔3管测1次酶活，将有酶活的溶液试管合并，再用聚乙二醇反渗透。所得溶液即为部分纯化的SOD酶液。1.3.7仙女座功能饮料的准备和检测仙人掌SOD功能饮料的制备工艺流程：1.3.7.1.原材料的选择、清洗和去除选择无病斑、无虫害、新鲜、绿色、肉质肥厚的仙人掌片和无病虫害、鲜嫩的黄瓜，清洗除去杂质。1.3.7.2片仙人掌除刺，去掉仙人掌的表面硬皮后，将其切成30cm×10cm薄片。黄瓜去皮后切除两端挂蒂，切成3～5cm厚的块状。1.3.7.3热护色黄瓜90℃热烫3～5min，投入0.04%的醋酸锌护色液，浸泡15min。1.3.7.制备成液溶液经热烫护色的黄瓜迅速用水冷却，并将烫漂液冲洗干净，以1︰1.5(g/mL）加水打浆，制得浆液备用。仙人掌以1︰1.5(g/mL）加水打浆，制得浆液备用。1.3.7.出液过滤、搅拌制得的仙人掌浆液、黄瓜浆液用4层纱布过滤，滤出液置入烧杯中，用磁力搅拌器搅拌30～60min,4℃环境下静置3～4h。滤出上清液，弃去沉淀。1.3.7.h4.0将称量好的蔗糖、乙基麦芽酚加入黄瓜汁中，加入柠檬酸调pH4.0。饮料配方：黄瓜汁100mL、仙人掌汁100mL、蔗糖10g(5%）、柠檬酸0.15g(0.0008%）、乙基麦芽酚0.03g(0.002%）。1.3.7.7杀戮调配好的黄瓜汁装瓶后采用90℃，30min杀菌，冷却至室温。将微波30s灭菌处理过的仙人掌汁装入事先杀菌过的黄瓜汁中。1.3.7.8个酶活力研究按照1.3.3测定饮料中SOD酶活力。2结果与分析2.1不同纯化方法对蛋白质和酶活力的影响仙人掌经盐溶、盐析、透析和SephadexG-75层析纯化后，酶活力、活力回收率、提纯倍数如表1所示。由表1可知，经提取和部分纯化后酶活力的回收率为19.23%，纯化倍数9.13。随着纯化步骤的进行，蛋白质和酶活力总量逐渐减少，但SOD比活力逐渐提高。仙人掌SOD粗酶总活力13760U，含量丰富，可以仙人掌为原料制备SOD功能饮料。2.2sod的洗脱从图1中可看出，酶活力随着洗脱体积增加而增高，在缓冲液洗脱体积在80mL左右，酶活力达到最高。洗脱过程是大分子量组分先被洗脱，小分子量的组分后被洗脱。SOD在50mL以后逐渐被洗脱出。葡聚糖凝胶（Sephadex）内部具有网状筛孔。SephadexG-75凝胶可区分分子量在3000～70000Da之间的分子，SOD分子量在32000～40000Da，可以进入SephadexG-75的网状结构，流出时间的长短居中，如图1中尖峰的位置所示（对应于约83mL洗脱体积）。2.3仙人掌与仙人掌的混合式在选择复合原材料时考虑到饮料的色泽和风味等方面的因素，采用与仙人掌相接近的黄瓜作为饮料的另一种原材料。黄瓜本身的抗褐变能力强，并且在掩盖仙人掌青涩味方面也起到了一定效果。2.4漂烫护色。为了保留饮料的sod酶，黄瓜可做在果蔬组织内含有多种酚类物质和多酚氧化酶，在加工过程中，由于组织破坏与空气接触，使酚类物质被多酚氧化酶氧化，生成褐色的醌类物质，从而影响外观，也破坏了风味和营养价值。这种褐变主要来源于酶促褐变，其关键作用的因子有酚类底物、酶和氧气。为保留饮料中SOD酶活力，仙人掌不做漂烫护色处理。黄瓜进行漂烫和护色处理能够钝化酶，软化组织，阻止叶绿素褪色和褐变，并提高出汁率。据文献报道，黄瓜采用90℃热烫3～5min，投入0.04%的醋酸锌溶液（pH8.0）中护色15min，效果最佳。2.5仙人掌汁的澄清采取的澄清法是将制备好的黄瓜汁、仙人掌汁分别用磁力搅拌器搅拌30和60min（仙人掌汁含的果胶多，搅拌时间长，能充分破坏胶体结构，使沉淀物快速地沉淀下来），移入4℃冰箱中自然澄清3～4h，取出滤除沉淀。此法结合自然澄清和冷冻澄清完成。利用此方法制成的饮料证明澄清效果比较满意，饮料放置一段时间后并无沉淀出现。2.6采用冷杀菌工艺仙人掌SOD保健饮料，如用热杀菌进行灭菌，将会导致仙人掌SOD酶活性丧失，所以不能采取传统热杀菌技术，需要采用冷杀菌工艺。生物体作为极性介质吸收微波能量后使生物体的蛋白质产生变性凝固，从而达到杀菌目的，且对试验条件要求低，可以作为仙人掌SOD保健饮料的杀菌方法。2.7化学成分饮料饮料中所添加的乙基麦芽酚和果糖，前者对苦涩有消杀作用，对特有风味有“乳化作用”，具有抗菌，防腐性能；能有效延长食品储存期；后者使风味将更醇厚，有利于糖尿病患者和肥胖患者食用。制备的饮料口感细腻，具有仙人掌和黄瓜独特的清香味；色泽青绿，无肉眼可见沉淀，其具有的SOD酶活力为2U/mL。3仙人掌黄瓜饮料制备工艺sod米邦塔食用仙人掌经匀浆、硫酸铵盐溶、盐析、SephadexG-75凝胶层析等方法提取纯化SOD，提取粗酶活力137.60