大豆皂甙对ames试验的抗突变性研究

大豆皂甙对ames试验的抗突变性研究

近年来，天然植物的药理学已经成为研究的重点。本项课题基于前人理论,采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验),诱导出细菌突变模型,旨在对SS的抗遗传物质突变作用进行研究。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验报告大豆皂甙(SS),日本小城制药株式会社提供,纯度97%~99%,淡黄色粉末。使用前经滤膜除菌,避光4℃备用。1.1.2大学东南角培养敌克松(Dexon),东北大学化学系提纯,纯度94%。2-氨基芴(2-AF),日本大塚制药株式会社出品,避光4℃备用。1.1.3试验中使用的蘑菇组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA98、TA100,美国加州大学Ames实验室提供。1.1.4试验使用肝微粒酶代谢激活系统s9混合物由实验室自制并鉴定。1.2型蛋白酶iii和蛋白、l-组氨酸制约的酶D-生物素、低融点琼脂糖(LMAP)、氧化型辅酶II购自美国Promega公司;琼脂粉、蛋白胨、L-组氨酸购自美国Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO)、Tris等为国产分析纯试剂。1.3方法1.3.1标准平板加入试验采用1983年Ames等人修订方法进行标准平板掺入试验。每份样品做三块平皿,重复试验二次以上。每次试验结束计数每皿回变菌落数,计算每皿平均回变菌落值1.3.2ss与模型突变物模型的同时混合为在抗突变试验中能同时揭示出SS抗突变作用机理,采用四种不同的处理方式进行Ames试验:A.SS、模型突变物(加与不加S9混合液)与指示菌株同时混合接触;B.SS与模型突变物(加与不加S9混合液)先接触一定时间后加入指示菌株;C.模型突变物(加与不加S9混合液)先与菌株接触一定时间,再用生理盐水洗菌,后加入SS;D.SS先与指示菌株接触一定时间后,再用生理盐水洗菌,后加入模型突变物(加与不加S9)。2结果2.1ss对碱基置换型突变活性的抑制作用将0.1ml不同浓度的SS、模型突变物(加与不加S9混合液)与指示菌株同时混合接触进行Ames试验。从表1的抑制率来看,SS对TA98菌株于500μg/皿剂量时显强度抑制而对TA100菌株于100μg/皿剂量即显强度抑制,提示SS对碱基置换型突变活性的抑制作用可能稍强于对移码型突变活性的抑制作用。由表2可以看出,对于加入S9的间接型突变剂,SS对TA98菌株、TA100菌株的回变菌落生长同样具有明显抑制作用(P<0.01)。其中TA98菌株回变菌落生长抑制具有良好的剂量-效应关系,但TA100菌株抑制作用未显现出明显的量-效关系。2.2ss对ta98菌株突变活性的影响将0.1ml不同浓度SS与模型突变物(加与不加S9混合液)37℃温育接触20min,然后加入指示菌株进行Ames试验。由表3、表4的抑制率来看,SS2、20、100、500μg/皿各剂量组使TA100菌株突变活性呈中度以上抑制,而SS对TA98菌株诱变活性仅于500μg/皿较高剂量时呈弱抑制。试验结果表明SS可灭活某类直接突变物和间接突变物,而对碱基置换型突变活性的灭活作用要强于移码型突变活性。2.3ss对ta98、ta200生长和稳定性的影响将0.1ml模型突变物(加与不加S9混合液)先与菌株37℃温育接触20min,再用生理盐水洗菌,然后加入0.1ml不同浓度的SS进行Ames试验。由表5、表6的结果可见,TA98菌株和TA100菌株回复突变菌落数均随SS剂量增加而减少,有明确剂量-效应关系。从抑制率来看,SS0.5~500μg/皿各剂量组均使TA98、TA100两种菌株突变活性由较弱抑制作用逐渐增为强度抑制作用。上述结果提示SS试验所用各剂量组可以抑制已受直接突变作用和间接突变作用突变损伤的表达,SS可使细菌受损的DNA得以部分修复。2.4ames试验将0.1ml不同浓度的SS先与指示菌株37℃温育接触20min后,再用生理盐水洗菌,然后加入模型突变物(不加S9混合液)进行Ames试验。由表7所列结果可见,SS0.5~500μg/皿各剂量组使TA98、TA100两种菌株回变菌落值与阳性对照组比较均无显著性差异。表明SS未呈现出使细胞免受直接突变物突变损伤的保护作用,而对于间接突变物的作用有待于进一步研究。3ss的抗突变活性Ames试验是当今世界范围内最广泛应用的突变性/抗突变性的检测方法,其方法简便、快速,可以较好地反映受试物在基因水平的遗传学效应。在本次Ames试验结果显示,SS在加与不加肝微粒体酶情况下对TA98、TA100菌株均显示出抗突变作用。A和B两种处理方式的直接Ames(-S9)试验(表1、表3)见到,SS对直接诱变物Dexon有灭活作用,而且对碱基置换型突变物的灭活作用似乎强于移码型突变物。A、B两种处理的间接突变试验(表2、表4)见到,在所设的SS2μg/皿到500μg/皿的剂量水平下对2-AF诱发的TA100突变均呈中度拮抗,其中B种处理条件下SS对TA98菌株的抗突变效果明显较弱,直到500μg/皿时才显示出微弱的抑制效应,表明SS对2-AF诱发的突变拮抗效果不如对直接突变剂诱导的突变,同时也有对移码型突变的拮抗作用不如对碱基置换型突变拮抗作用的倾向。C种处理的Ames试验(表5、表6)见到无论对Dexon(-S9)还是对2-AF(+S9)诱发的回复突变,SS在50μg/皿以上剂量均显现出了强度的抗突变效应,而且对两种菌株的作用强度未见差异,反映出SS具有很好的促使DNA修复的抗突变作用。在D种处理(表7)的Ames试验结果中SS未见抗突变活性,表明SS对菌体细胞免受Dexon(-S9)诱变损伤无保护作用存在。总之,通过Ames试验证实SS对基因突变有拮抗作用,整个Ames试验过程可见SS加入量与抗突变效应之间基本存在量-效趋势,这一点在每次试验结果的MR值比较所见中也得到证实。SS的抗基因突变作用较强,很多情况下在2μg/皿甚至0.5μg/皿剂量时即显现抗突变作用,SS对直接和间接突变剂均起灭活作用,但对前者的灭活作用似乎更强些。SS对不同类型的基因突变也都有抑制效应,看来对碱基置换型突变抑制作用似乎更好些。另外,从前述C种处理的Ames试验结果亦可以看出,SS无论对Dexon(-S9)还是对2-AF(+S9)均呈现出强度的抗突变效应,提示SS可通过促进靶细胞和靶分子DNA损伤得以恢复,使进入细胞内的突变物损害作用降低,从而发挥抗突变作用。由于SS样