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文档简介
会计学1甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein,AFP)(GenBank登录号:NM_001134.1)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关,请根据基因表达的检测方法,设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括:实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。讨论题目第1页/共13页甲胎蛋白是人胚胎期血清中的主要蛋白成分。甲胎蛋白是一种糖蛋白,正常情况下,这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞,在胎儿13周AFP含量占血浆蛋白总量的1/3,胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失。在妊娠30周达最高峰,以后逐渐下降,出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右,约40mg/L,在周岁时接近成人水平。正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升,如在成人血清中含量过高,则提示有肝癌的可能。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)第2页/共13页1、掌握RT-PCR技术、northern印记杂交的原理和方法2、了解实验的操作方法和步骤3、判断基因在转录水平的表达情况实验目的第3页/共13页使用细胞RNA提取技术,然后通过逆转录合成cDNA,PCR扩增,利用琼脂糖凝胶电泳技术,测定AFPmRNA的表达。逆转录PCR,是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板经反转录酶或随
机引物的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段检测基因表达。实验方法及原理第4页/共13页1、提取mRNA2、反转录cDNA链4、凝胶电泳3、PCR扩增5、结果显示实验技术路线第5页/共13页1、若有AFP基因表达,则在与其反转
录cDNA链分子量平行处应有检测信号。
2、若AFP基因未表达,则在与其反转
录cDNA链分子量平行处没有检测信号。结果分析第6页/共13页Northern印迹杂交是指将RNA变性及电泳分离后,将其转移到固相支持物上,然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小的过程。RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western
blot。Northern印记杂交实验原理第7页/共13页1、若出现明显杂交带,则表明细胞组织内有AFP基因的表达,则会有患肝癌的风险。2、若没有出现明显杂交带,则表明细胞组织内基因未表达。结果分析第8页/共13页Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感性较PCR技术低,但其特异性强,假阳性率低,因此被认为是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。Northern印记杂交与PCR方法的比较第9页/共13页诊断原发性肝癌。检测AFP的含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一,由于肝癌的癌细胞能合成或分泌较多的AFP释放入血的缘故。正因为如此,医生们就把检测人体血液中的AFP作为诊断肝癌的重要依据,并把AFP称为“肝癌标志物”。检测AFP是诊断肝癌的一种简便、灵敏、快捷的方法,现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值,用AFP诊断肝癌的“专一性”仅次于病理学检查。血清AFP升高,还可出现于畸胎瘤、睾丸和卵巢肿瘤等。急性肝炎和肝硬化的鉴别诊断肝细胞再生时期,AFP在血液中呈阳性,急、慢性肝炎、肝硬化时会有肝细胞再生,因而AFP在血液中的浓度升高。一般急性肝病,可随病情好转
AFP含量下降或正常,肝硬化可呈下降或持续低水平,肝癌则逐渐上升。应用(临床意义)第10页/共13页先天性疾病的诊断先天性疾病的诊断:检测羊水中AFP含量的意义已引起注意,Rendle用放射免疫法检测,发现无脑儿羊水中含量显着升高。正常妊娠12~16周羊水AFP含量为21.1±1.2mg/L,以后逐月下降,足月时为0.5±0.2mg/L。无脑儿患者在妊娠26~31周为95.7±19.3mg/L,32-38周为25.7±5.9mg/L。先天性肾病及脊柱裂也有类似报道。因此用放免法检测羊水中AFP含量,有助于某些先天性疾病的出生前诊断。母体血中A
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