第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构课件

核磁共振方法解析蛋白质结构核磁共振方法解析蛋白质结构1核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法优点：不需结晶；可研究动力学。缺点：受分子量限制，需要标记。核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法优点：不需结晶；可研究2MalatesynthaseG(82kDa)MalatesynthaseG(82kDa)3RichardRobertErnst

ErnstwasawardedtheNobelPrizeinChemistryin1991forhiscontributionstowardsthedevelopmentofFourierTransformnuclearmagneticresonancespectroscopyandthesubsequentdevelopmentofmulti-dimensionalNMRtechniques.RichardRobertErnstErnstwas4KurtWüthrich

HewasawardedhalfoftheNobelPrizeinChemistryin2002for"hisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution".KurtWüthrichHewasawardedh5核磁共振的原理自旋量子数（I）

原子序数和原子质量都为偶数：I=0(12C,16O)原子序数为奇数，原子质量为偶数：I=整数(14N,2H,10B)原子质量为奇数：I=半整数(1H,13C,15N,31P)核磁共振的原理自旋量子数（I）6自旋状态（M）M=I,(I-1),(I-2),…,-I

对于1H,13C,15N,31P来说: M=1/2,-1/2自旋状态（M）7凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生能级裂分，共振吸收一特定频率的射频电磁场能量的现象，即为核磁共振。Bo=0Bo>0ΔE=γhBo

/2π=hυabγ为磁旋比，由核的性质所决定。凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生能级裂分，共振吸收一8核磁共振的灵敏度

Nα-Nβ

Nα/Nβ=eΔE/kT

ΔE=γhBo/2π对于在400MHz(Bo=9.5T)磁场下的1H：Nα/Nβ=1.000064核磁共振的灵敏度9磁场越强，灵敏度越高磁旋比越大，灵敏度越高γ1H=26.75rad/G；γ13C=6.73rad/G；γ15N=-2.71rad/G核的丰度越高，灵敏度越高第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件10第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件111H谱天然丰度高；灵敏度高。13C谱天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好15N谱天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好1H谱12核磁共振的频率

ΔE=γhBo

/2π

υ=γBo

/2π

ΔE=hυ

在常用磁体（2.35-18.6T）下，1H的共振频率在100-800MHz范围，13C为它的1/4，15N为它的1/10。10-10 10-810-610-410-2100102wavelength(cm)

g-rays

x-rays

UVVIS

IR

m-waveradio核磁共振的频率10-10 10-810-613进动(larmor)频率

ω=2πν

ω0=γB0进动(larmor)频率14第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件15第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件16第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件17核磁共振的主要参数化学位移耦合常数峰强核欧佛豪斯效应（NOE）横向驰豫时间纵向驰豫时间线宽核磁共振的主要参数化学位移18化学位移不同的原子处于不同的化学环境，即处于不同的电磁环境,因此表现出不同的共振频率：

υ=γ（Bo±B）/2πω=2πυ=γ(Bo±B)化学位移不同的原子处于不同的化学环境，即处于不同的19逆磁屏蔽逆磁屏蔽20微磁环境微磁环境21Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)22化学位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH3化学位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH323AromaticImines AmidesHCb,g,d,...HCawater109876543210AromaticImines AmidesHCb,g,d24影响化学位移的效应：环流位移效应环状分子的大π电子云产生的附加磁场对核的影响顺磁离子效应金属离子对周围核的影响pH滴定效应不同pH下各基团解离情况的不同对化学位移的影响影响化学位移的效应：25耦合常数自旋耦合

共价键（1-4个键）相连核之间的特性张量的相互作用13C1H1H1Hone-bondthree-bond耦合常数自旋耦合13C1H1H1Hone-bondthree26自旋裂分

由于被测核与相邻核自旋耦合引起的谱线裂分，裂分的大小称为耦合常数aaabbabbI

SSSIIJ(Hz)自旋裂分aaabbabbI SSSIIJ(Hz)27第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件28耦合常数不随磁场的变化而变化两核耦合引起对方谱线裂分的大小相等相距越远、所隔键数越多，耦合越弱重原子比轻原子耦合强耦合常数的大小与耦合核的二面角有关第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件29第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件30峰强、驰豫和线宽峰强与共振粒子数成正比。纵向驰豫是高能原子核将其多余能量交给周围介质而返回低能态的过程。横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动性等影响线宽。峰强、驰豫和线宽峰强与共振粒子数成正比。31纵向驰豫（T1）纵向驰豫（T1）32横向驰豫（T2）横向驰豫（T2）33NOE不同核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与核间距的六次方成反比。若用射频照射核A，其谱峰被抑制，与其空间靠近的另一核B的谱峰会略有增强，其增强的程度，即为NOE强弱的度量。因NOE的强度与核间距有关，所以是分子结构中的最重要参数。NOE不同核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与核间距的六次34一维谱共振峰强度随频率（化学位移）变化一维谱共振峰强度随频率（化学位移）变化35第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件36二维谱吸收峰强度对两个频率变量作图二维谱吸收峰强度对两个频率变量作图37COSYCOSY38TOCSYTOCSY39NOESYNOESY401H共振的分布1H共振的分布41异核二维谱异核二维谱42多维谱多维谱43多维NMR解析蛋白质结构多维NMR解析蛋白质结构44谱峰认证谱峰认证45自旋体系认证自旋体系认证46第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件47序列认证序列认证48第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件49第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件50NOE认证TOCSY NOESYLeuAlaAsnGlyNHHCLeuAlaAsnGlyNHHCNOE认证TOCSY NOESYLeuAla51用于NMR结构计算的约束NOE—5Å化学位移—二级结构偶极常数—二面角氢氘交换—氢键顺磁驰豫增强(PRE)—远距离（30Å）残余偶极耦合(RDC)—空间定向用于NMR结构计算的约束52特征NOE与二级结构特征NOE与二级结构53化学位移与二级结构化学位移与二级结构54偶极耦合与二面角偶极耦合与二面角55氢氘交换与结构和氢键氢氘交换与结构和氢键564.04.0(Has)4.08.0 (NHs) 7.0t=0-NoD2OAddD2Ot=t1t=t24.04.04.08.0 (NHs) 7.0t=57第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件58由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构59StrongNOE 1.8-2.7ÅMediumNOE 1.8-3.3ÅWeakNOE 1.8-5.0Å3JNa<5Hz-80<f<403JNa>8Hz-160<f<-80StrongNOE 1.8-2.7Å3JNa<560第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件61核磁共振谱仪的组成MagnetProbeConsoleComputer核磁共振谱仪的组成Magnet62对磁体的要求高磁场强度高稳定性高均匀性对磁体的要求63高磁场强度：高分辨率高灵敏度高磁场强度：高分辨率高灵敏度64信噪比的完全方程信噪比的完全方程65第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件66第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件67第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构ppt课件68样品的准备溶剂的选择

1.样品在其中有高溶解度；

2.在我们所感兴趣的波谱范围内没有溶剂峰；

3.在做变温实验的温度范围内保持液体状态。

通常使用一些氘代溶剂

减少溶剂峰的干扰采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用H2O

是生物分子最适宜的溶剂(90%H2O,10%D2O)样品的准备溶剂的选择69蛋白质NMR研究的溶液条件pH不要大于7。缓冲体系要保证蛋白质的稳定及高溶解度。蛋白质的浓度通常要求有数mM。避免缓冲液中其他成份对蛋白质谱图的干扰。无机