蛋白质医学知识讲座

蛋白质医学知识讲座蛋白质医学知识讲座第1页2蛋白质概念存在于全部生物细胞中，是由20种α－氨基酸按一定序列经过酰胺键（蛋白质化学中称为肽键）缩合而成，含有较稳定构象，是组成生物体最基础结构物质和功效物质。有些蛋白质尚含有非蛋白成份。蛋白质医学知识讲座第2页3第一节氨基酸（aminoacid）123页一、氨基酸—蛋白质构件分子二、氨基酸分类三、氨基酸酸碱化学四、氨基酸化学反应五、氨基酸光学活性和光谱性质六、氨基酸混合物分析分离蛋白质医学知识讲座第3页4一、氨基酸—蛋白质构件分子蛋白质水解氨基酸普通结构蛋白质医学知识讲座第4页5

1.蛋白质水解水解类型使用试剂优点缺点酸水解H2SO4(4M)或HCl(6M),

进行回流煮沸20h无消旋作用，产物为L-氨基酸色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸个别水解，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺基碱水解NaOH(5M)共煮10-20h

色氨酸稳定有消旋作用，大多数aa被破坏，产物为D-和L-氨基酸混合物；精氨酸脱氨酶水解蛋白酶无消旋作用，氨基酸不被破坏不完全水解，需各种酶协同作用完全水解常见蛋白质氨基酸（基础氨基酸－－20种）不常见蛋白质氨基酸－－几个蛋白质医学知识讲座第5页6

2.氨基酸普通结构（20种基础氨基酸）结构通式结构特点其它特征蛋白质医学知识讲座第6页7(1)结构通式COOHCα

HH2NRCOO－Cα

HRH3N＋或蛋白质医学知识讲座第7页8构型氨基酸构型指α－碳构型（D与L型）。组成蛋白质氨基酸是L-型蛋白质医学知识讲座第8页9除脯氨酸为α-亚氨基酸外，均为L-α-氨基酸。除甘氨酸外,α-碳原子为不对称碳原子.都含有旋光性。(2)结构特点蛋白质医学知识讲座第9页10其它特征124页①在中性pH时－－兼性离子②都有特殊白色结晶形状，可用来判别氨基酸。溶点很高。③除胱氨酸和酪氨酸外，普通都能溶于水。蛋白质医学知识讲座第10页11二、氨基酸分类（体内氨基酸）常见蛋白质氨基酸(20种)不常见蛋白质氨基酸(少数几个）非蛋白质氨基酸(150各种)蛋白质医学知识讲座第11页121.常见蛋白质氨基酸（20种，124页表3－1））蛋白质医学知识讲座第12页13按R基团化学结构①脂肪族氨基酸：15种②芳香族氨基酸：3种，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸③杂环氨基酸：2种，组氨酸、脯氨酸Met在生物合成中是一个主要甲基供体在大多数酶活性中心都发觉有Ser残基蛋白质医学知识讲座第13页14依据侧链R基团极性

(

127页表3－2)①带正电荷极性R基氨基酸：3种

④带负电荷极性R基氨基酸：2种②不带电荷极性R基氨基酸：7种③非极性R基氨基酸：8种

非极性氨基酸在维持蛋白质三维结构中起着主要作用。？分子极性？？生理条件下，侧链带有一个正电荷碱性最强氨基酸，生理条件下完全质子化是在生理pH条件下唯一含有缓冲能力氨基酸。蛋白质医学知识讲座第14页15按分子中氨基和羧基数目酸性氨基酸：2种碱性氨基酸：3种中性氨基酸：其余生理条件下，侧链带有一个正电荷碱性最强氨基酸，生理条件下完全质子化是在生理pH条件下唯一含有缓冲能力氨基酸。蛋白质医学知识讲座第15页16依据人体能否本身合成①必需氨基酸：8种赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Try)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)②半必需氨基酸：2种，Arg、His婴儿期供给不足③非必需氨基酸：其余要求记住！氨基酸结构、单字符、三字符号第125-127页蛋白质医学知识讲座第16页17LeuL-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+

-C-C-C-C-NH3+-C--C--OH-C-NCentrallineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-N

N+=

C-C-C-C

C-C-C-C

CC-C

CCCHNC-COOH

a-C-C

OHGlnQAsnNAspDGluEPheFArgRLysKHisHGlyGAAAlaVValI

IleYTyrSerSThrTMetMCysCTrpWNon-polarPolar蛋白质医学知识讲座第17页182.不常见蛋白质氨基酸

128页

是在蛋白质合成后由常见氨基酸经修饰而来.

蛋白质医学知识讲座第18页193.非蛋白质氨基酸

129页大多是L-氨基酸衍生物细菌中含有各种D-型氨基酸有一些是主要代谢物前体或代谢中间物（β－丙氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸等）.蛋白质医学知识讲座第19页20三、氨基酸酸碱化学129页氨基酸兼性离子形式氨基酸解离氨基酸等电点氨基酸甲醛滴定蛋白质医学知识讲座第20页211.氨基酸兼性离子形式两个事实溶点高；离子晶格能使水介电常数增高；蛋白质医学知识讲座第21页222.氨基酸解离酸碱质子理论（丹麦化学家布朗斯特和英国化学家劳里于1923年提出

HA＋B

A-+BH

氨基酸是一类两性电解质，完全质子化时－－－多元酸碱作用(质子受体)酸作用(质子供体)COO－Cα

HRH3N＋COOHH3N＋或COOH蛋白质医学知识讲座第22页23甘氨酸解离(分步解离)HHHA＋A0A－兼性离子Ka1解离常数Ka2解离常数OH－－＞蛋白质医学知识讲座第23页24解离常数

131－133页表3－3解离常数pKa：表示解离基团有二分之一解离时pH。

A＋－

A0

＋H＋－A－＋H＋

解离常数按酸性递减次序编号为：pKa1，pKa2、pKa3等。氨基酸解离常数用测定滴定曲线方法求K1=[A0][H+][A+][A-][H+]K2=[A0]K1=[H+]

pK1=pHK2=[H+]

pK2=pH蛋白质医学知识讲座第24页25蛋白质医学知识讲座第25页26氨基酸解离常数用测定滴定曲线方法求甘氨酸滴定曲线蛋白质医学知识讲座第26页27谷氨酸滴定（解离）曲线

蛋白质医学知识讲座第27页28组氨酸滴定（解离）曲线

蛋白质医学知识讲座第28页29赖氨酸滴定（解离）曲线

蛋白质医学知识讲座第29页30Handerson-Hasselbalch公式pH=pKa+lg[质子供体］[质子受体］pH=pKa+lg（[A-]/[HA]）=pKa+lg（[碱]/[酸]）

可计算出在任一pH条件下一个氨基酸各种离子百分比氨基酸带电情况与溶液pH值相关。蛋白质医学知识讲座第30页31例：计算在pH5.0时，甘氨酸阳离子、两性离子所占百分比？pK1

2.34pK2

9.60pH=pK+lg[质子供体］[质子受体］蛋白质医学知识讲座第31页32生理条件下有显著冲缓作用氨基酸132页缓冲剂：能阻止因为酸或碱加入而引发[H＋]改变。组氨酸侧链咪唑基pK为6.0pH=pK+lg[质子供体］[质子受体］蛋白质医学知识讲座第32页333.氨基酸等电点（isoelectricpoint,pI,133页）等电点：当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之为负。氨基酸在等电点时溶解度最低．不一样氨基酸等电点不一样．H+HHHA0A－A＋pK1pK2H+蛋白质医学知识讲座第33页34应用依据氨基酸电荷不一样（电泳法,离子交换层析）分离混合物。依据氨基酸等电点不一样（调整溶液pH）分离混合物。电泳在外电场作用下，带电颗粒，如不处于等电点状态分子，将向着与电性相反电极移动，这种现象称为。蛋白质医学知识讲座第34页35等电点计算133页表3－3

1.侧链不解离中性氨基酸

pI=(

pK1+pK2

)/2

2.侧链含有可解离基团氨基酸酸性氨基酸pI=(

pK1+pKR2

)/2硷性氨基酸

pI

=(

pK2+pKR3

)/2半胱氨酸pI

=(

pK1+pKR2

)/2酪氨酸

pI

=(

pK1+pKR2

)/2蛋白质医学知识讲座第35页364.氨基酸甲醛滴定氨基酸不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定α-氨基中氮原子是亲核中心，可发生亲核加成和取代反应。与甲醛发生羟甲基化反应蛋白质医学知识讲座第36页37四、氨基酸化学反应

135页α-氨基参加反应α-羧基参加反应α-氨基和α-羧基共同参加反应侧链R基参加反应蛋白质医学知识讲座第37页381.α-氨基参加反应与亚硝酸反应与酰化试剂反应烃基化反应生成西佛碱反应（Schiff）脱氨基反应与转氨基反应(见下册)蛋白质医学知识讲座第38页39（1）与亚硝酸反应是范斯莱克氨基氮测定法(vanSlykeaminonitrogenmethod)原理室温下蛋白质医学知识讲座第39页40（2）与酰化试剂反应①用于多肽链N末端aa标识和微量aa定量测定。②在多肽和蛋白质人工合成中被用作氨基保护剂。弱碱性溶液丹磺酰氯蛋白质医学知识讲座第40页41（3）烃基化反应首先被Sanger用来判定多肽或蛋白质N末端氨基酸。DNP-氨基酸黄色

2,4－二硝基氟苯弱碱性溶液DNFB或FDNB，亦称Sanger试剂2,4－二硝基氟苯－－DNFB或FDNB亦称Sanger试剂蛋白质医学知识讲座第41页42弱碱6mol盐酸中单肽链＋FDNBDNP－肽链（黄色）DNP－（N端）氨基酸＋n个氨基酸乙醚抽提后层析，与标准DNP－氨基酸比较，确定N端氨基酸蛋白质医学知识讲座第42页43FrederickSanger

(桑格)英国化学家，在生物化学领域贡献很大，他两次获诺贝尔奖1958和1980年；1953年确定了牛胰岛素一级结构；1975年和1977年确定了DNA两种用酶测序方法加减法和终止法。蛋白质医学知识讲座第43页44苯氨基硫甲酰衍生物

PTC-氨基酸苯乙内酰硫脲衍生物PTH-氨基酸（无色）在弱碱中硝基甲烷首先被Edman用于判定多肽或蛋白质N端氨基酸。苯异硫氰酸酯缩写为与苯异硫氰酸酯PITC蛋白质医学知识讲座第44页45Edman法测定氨基酸序列单肽链＋PITC弱碱乙醚抽提后层析，与标准PTH－氨基酸比较，确定N端氨基酸PTH-氨基酸+余下少一个氨基酸肽链

蛋白质医学知识讲座第45页46（4）生成西佛碱反应西佛碱是以氨基酸为底物一些酶促反应中间物。蛋白质医学知识讲座第46页472.α-羧基参加反应

第138页成盐和成酯成酰氯反应脱羧基反应叠氮反应蛋白质医学知识讲座第47页483.α-氨基和α-羧基共同参加反应与茚三酮反应成肽反应蛋白质医学知识讲座第48页49（1）与茚三酮反应茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，全部含有游离氨基氨基酸都生成紫色化合物（

570）。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成是黄色化合物（

440）。蛋白质医学知识讲座第49页50（2）成肽反应蛋白质医学知识讲座第50页513.侧链R基参加反应140页

蛋白质化学修饰：就是在较温和条件下，以可控制方式使蛋白质与一些试剂起特异反应，以引发蛋白质中个别氨基酸侧链或功效团发生共价化学改变。酪氨酸酚基

Millon反应（红色）、Foiln反应（蓝色）、Pauly反应（橘黄）

碘化、硝化精氨酸胍基：坂口反应（红色）、与环已二酮生成缩合物。苯丙氨酸和酪氨酸苯环：黄色反应（黄色）组氨酸咪唑基：Pauly反应（棕红色）苏氨酸和丝氨酸羟基：成酯反应Cys侧链上巯基（－SH）蛋白质医学知识讲座第51页52Cys侧链上巯基（－SH）－CH2－S－此阴离子是巯基反应形式。pKR=8.33蛋白质医学知识讲座第52页53与卤化烷生成稳定烷基衍生物可保护-SH以防被氧化。+ICH2COO-碘乙酸CH2COO－＋I－蛋白质医学知识讲座第53页54Cys巯基打开氮丙啶环为胰蛋白酶水解肽链提供了新位点。+CH2

CH2NH+H+AECysSCH2CH2NH3+蛋白质医学知识讲座第54页55巯基能和各种金属离子形成络合物-SH酶碰到重金属离子而生成硫醇盐时，将造成酶失活。对羟基汞苯甲酸蛋白质医学知识讲座第55页56与二硫硝基苯甲酸（DTNB）反应pH8.0时，在412nm波优点有强烈吸收。可用比色法定量测定半胱氨酸含量。硫硝基苯甲酸蛋白质医学知识讲座第56页57巯基易受空气或其它氧化剂氧化

－－－－两种氧化衍生物形成二硫化物：胱氨酸形成。胱氨酸二硫键蛋白质医学知识讲座第57页58形成磺酸基：对游离巯基含有保护作用，保护Cys巯基之间氧化。+HCOOOH过甲酸O3H

蛋白质医学知识讲座第58页59二硫键还原（打开）－SH

与－S－S－

是一对氧化还原体系。常见打开二硫键试剂主要有①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等。

HSCH2CH2OH蛋白质医学知识讲座第59页60氧化剂：过甲酸（HCOOOH）磺酸基蛋白质医学知识讲座第60页61还原剂：巯基乙醇游离巯基极易被氧化，需与卤化烷试剂作用将其保护。蛋白质医学知识讲座第61页62蛋白质医学知识讲座第62页63五、氨基酸光学活性和光谱性质

143页氨基酸旋光性氨基酸光谱性质蛋白质医学知识讲座第63页64

消旋作用（外消旋物与内消旋物）蛋白质医学知识讲座第64页65氨基酸光谱性质

145页可见光区都没有光吸收红外区和远红外区都有吸收（λ＜200nm)近紫外区（λ＝200nm~400nm)色氨酸280nm酪氨酸275nm苯丙氨酸257nm蛋白质医学知识讲座第65页66六、氨基酸混合物分析分离分配层析法普通原理纸层析柱层析离子交换层析气液层析薄层层析高效(压)液相层析HPLC蛋白质医学知识讲座第66页671.分配层析法普通原理固定相流动相层析系统固相液相半液相液相气相支持物静相动相被分离物质蛋白质医学知识讲座第67页68分配定律及分配系数混合物在层析系统中分离决定于该混合物组分在这两相分配系数。某一物质在A相中总量某一物质在B相中总量有效分配系数(Keff)=溶质在溶剂I中浓度(CA动相)溶质在溶剂II中浓度（CB静相）分配系数(Kd)=蛋白质医学知识讲座第68页69逆流分溶原理

149页混合物中

Y（Kd＝1）

Z

（Kd＝3）计算公式150页64溶剂A溶剂B总量64平衡后3232总量641616转移188转移21616161688总量3232总量163216上相转移下相固定总量4162416444总量8转移3121212124424248228812128822蛋白质医学知识讲座第69页70一定量某一溶质在一定量溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形越窄而高，这么有利于混合物中各物质完全分离。蛋白质医学知识讲座第70页712.纸层析支持物:纸,纸上羟基含有亲水性，所以能吸附一层水作为固定相，而通常有机溶剂作为流动相。溶剂：酸溶剂系统和碱溶剂统。原理：是依据混合物中溶质物质极性造成分配系数不一样进行分离。溶剂前层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖蛋白质医学知识讲座第71页72相对迁移率Rf=X/Y

蛋白质医学知识讲座第72页731.点样纸层析操作2.展层3.显色4.分析蛋白质医学知识讲座第73页74离子交换柱层析152页填充物：离子交换树脂基质（带电基团）洗脱剂：一定pH阳离子交换树脂与阴离子交换树脂B-A+C+D-S-

G-A＋

B＋A+D-S-A+蛋白质医学知识讲座第74页75氨基酸与树脂亲和力①取决于它们之间静电吸引②和氨基酸侧链与树脂基质之间疏水相互作用。C+D-A＋

L＋

F-A+D-层析下来先后次序为：F-

A＋L＋

蛋白质医学知识讲座第75页76蛋白质医学知识讲座第76页77图示

蛋白质医学知识讲座第77页78搜集氨基酸分析仪图解153页蛋白质医学知识讲座第78页79氨基酸制备和应用情况1.氨基酸制备从蛋白质水解液中分离提取应用发酵法生产应用酶催化反应生成氨基酸有机合成法2.氨基酸用途蛋白质基础组成对生物体含有其它特殊生理作用，参加许多代谢作用，不少已用来治疗疾病用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂用于饲料添加剂调整皮肤pH值和保护皮肤功效蛋白质医学知识讲座第79页80第二节蛋白质概述

157页蛋白质化学组成与分类蛋白质构象和结构蛋白质生物学功效蛋白质医学知识讲座第80页81一、蛋白质化学组成与分类化学组成特点蛋白质分类蛋白质医学知识讲座第81页821.元素组成特点蛋白质含氮量靠近于16%蛋白质系数：1克氮所代表蛋白质质量(克数，6.25)蛋白质系数是凯氏定氮法测定蛋白质含量基础粗蛋白含量＝样品含氮量

6.25

蛋白质含量=样品蛋白氮

6.25有些还含有Ｓ／Ｐ／Ｆe/Cu/Zn/Mn等.元素C

H

O

N

百分比50~55

6~8

20~23

15~18

蛋白质医学知识讲座第82页83三聚氰胺是一个主要氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业，当前是主要尿素后加工产品。另外三聚氰胺还能够作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。