二维核磁共振谱讲义专家讲座

第四章二维核磁共振谱

4．1二维核磁共振概述1．什么是二维谱二维核磁共振(2DNMR)方法是有Jeener于1971年首先提出,是一维谱衍生出来新试验方法.引入二维后,降低了谱线拥挤和重合,提升了核之间相互关系新信息.因而增加了结构信息,有利于复杂谱图解析.尤其是应用于复杂天然产物和生物大分子结构判定,2DNMR是当前适合用于研究溶液中生物大分子构象唯一技术.一维谱信号是一个频率函数,记为S(ω),共振峰分别在一条频率轴上.而二维谱是两个独立频率变量信号函数,记为S(ω1,ω2),共振峰分布在由两个频率轴组成平面上.2D-NMRb最大特点是将化学位移,偶合常数等参数字二维平面上展开,于是在普通一维谱中重合在一个频率轴上信号,被分散到两个独立频率轴组成二维平面上.,同时检测出共振核之间相互作用.二维核磁共振谱讲义专家讲座第1页2。二维谱试验A.标准上二维谱能够用概念上不一样三种试验取得,(如图4.1),(1).频率域试验(frequency-frequency)(2).混合时域(frequency-time)试验(3).时域(time-time)试验.它是取得二维谱主要方法,以两个独立时间变量进行一系列试验,得到S(t1,t2),经过两次傅立叶变换得到二维谱S(ω1,ω2).通常所指2D-NMR均是时间域二维试验

二维核磁共振谱讲义专家讲座第2页图4.12D-NMR三种取得方式二维核磁共振谱讲义专家讲座第3页B)二维核磁共振时间分割二维核磁共振谱讲义专家讲座第4页二维谱试验中，为确定所需两个独立时间变量，要用特种技术－时间分割。即把整个时间按其物理意义分割成四个区间。（如图所表示）

（1）预备期：预备期在时间轴上通常是一个较长时期，使核自旋体系回复对平衡状态，在预备期末加一个或多个射频脉冲，以产生所需要单量子或多量子相干。（2）发展期：在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发，此时间系控制磁化强度运动，并依据各种不一样化学环境不一样进动频率对它们横向磁化矢量作出标识。（3）混合期：在此期间经过相干或极化传递，建立检测条件。4）检测期：在此期间检测作为t2函数各种横向矢量FID改变以及它初始相及幅度受到t1函数调制。

与t2轴对应ω2（ν轴），通常是频率轴，与t1轴对应ω1是什么，取决于在发展是何种过程。

二维核磁共振谱讲义专家讲座第5页相干(ccherence):是描述自旋体系状态波函数之间关系一个物理量。，它通常没有简单模型，它是横向磁化及相位量。（不但包含⊿m=1,而且包含⊿m=0,⊿m=2状态之间关系)它能够经过射频脉冲作用传递。C.试验过程：用固定时间增量⊿t1依次递增t1进行系列试验，重复叠加，因t2时间检测信号S(t2)振幅或相位受到s(t1)调制，则接收信号不但与t2相关，还与t1相关，每改变一个t1，统计S(t2),所以得到分别以时间变量t1,t2为行列排列数据矩阵，即在检测期取得一组FID信号，组成二维时间信号S(t1,t2)。因t1,t2是两个独立时间变量，能够分别对它们进行傅立叶变换，一次对t2,一次对t1,两次傅立叶变换结果，能够得到两个频率变量函数S(ω1,ω2)。如图二维核磁共振谱讲义专家讲座第6页二维核磁共振谱讲义专家讲座第7页3．二维谱表示方式（1）堆积图(stackedplot).堆积图优点是直观,含有立体感.缺点是难以确定吸收峰频率。大峰后面可能隐藏小峰，而且耗时较长。(2)等高线（Contourplot）等高线图类似于等高线地图，这种图优点是轻易取得频率定量数据，作图快。缺点是低强度峰可能漏画。当前化学位移相关谱广泛采取等高线。二维核磁共振谱讲义专家讲座第8页图4.3堆积图等高线二维核磁共振谱讲义专家讲座第9页4．二维谱峰命名（1）交叉峰（crosspeak）:出现在ω1≠ω2处，（即非对角线上）。从峰位置关系能够判断哪些峰之间有偶合关系，从而得到哪些核之间有偶合关系，交叉峰是二维谱中最有用部分。（2）对角峰（Autopeak）:位于对角线（ω1＝ω2）上峰，称为对角峰。对角峰在F1和F2轴投影。二维核磁共振谱讲义专家讲座第10页图4。5经典二维谱示意图二维核磁共振谱讲义专家讲座第11页5．二维谱分类二维谱可分为三类：1）J分辨谱（Jresolvedspectroscopy）J分辨谱亦称J谱或者δ－J谱。它把化学位移和自旋偶合作用分辨开来，包含异核和同核J谱。2）化学位移相关谱(chemicalshiftcorrelationspectroscopy)化学位移相关谱也称δ－δ谱，是二维谱关键，通常所指二维谱就是化学位移相关谱。包含同核化学位移相关谱，异核化学位移相关谱，NOESY和化学交换。3）多量子谱（multiplequantumspectroscopy）用脉冲序列能够检测出多量子跃迁，得到多量子二维谱。二维核磁共振谱讲义专家讲座第12页4．2化学位移相关谱（CorrelatedSpectroscopy,COSY）

二维化学位移相关谱包含同核化学位移相关谱（Homonuclearcorrelation）1）经过化学键：COSY,TOCSY,2D-INADEQUATE。2）经过空间：NOESY,ROESY。异核化学位移相关谱（Heteronuclearcorrelation）强调大偶合常数：1H-13C–COSY强调小偶合常数，压制大偶合常数：COLOC(远程1H-13C–COSY)

二维核磁共振谱讲义专家讲座第13页4.2.1同核化学位移相关谱一。COSY(Correlatedspectroscopy)所谓COSY系指同一自旋体系里质子之间偶合相关。1H-1H-COSY能够1H-1H之间经过成键作用相关信息，类似于一维谱同核去偶，可提供全部1H-1H之间关联。所以1H-1H-COSY是归属谱线，推导结构及确定结构有力工具。二维核磁共振谱讲义专家讲座第14页1。COSY－90。基本脉冲序列包含两个基本脉冲在此脉冲作用下，依据发展期t1不一样，自旋体系各个不一样跃迁之间产生磁化传递，经过同核偶合建立同种核共振频率间连接图。此图二个轴都是1Hδ在ω1＝ω2对角线上能够找出一维1H谱相对应谱峰信号。经过交叉峰分别作垂线及水平线与对角线相交，即能够找到对应偶合氢核。所以从一张同核位移相关谱可找出全部偶合体系，即等于一整套双照射试验谱图。二维核磁共振谱讲义专家讲座第15页二维核磁共振谱讲义专家讲座第16页

COSYof2－丁烯酸乙酯二维核磁共振谱讲义专家讲座第17页2。COSY-45。基本脉冲：90。－t1-45。-ACQ.在COSY-90基础上，将第二脉冲改变成45。许多天然产物直接连接跃迁谱峰在对角线附近，造成谱线相互重合，不易解析。采取COSY-45。因为大大限制了多重峰内间接跃迁，重点反应多重峰间直接跃迁，降低了平行跃迁间磁化转移强度，即消除了对角线附近交叉峰，使对角线附近清楚。二维核磁共振谱讲义专家讲座第18页二维核磁共振谱讲义专家讲座第19页COSY-45二维核磁共振谱讲义专家讲座第20页COSY-90二维核磁共振谱讲义专家讲座第21页二维核磁共振谱讲义专家讲座第22页二维核磁共振谱讲义专家讲座第23页3.相敏COSY谱COSY谱，因为谱线信号色散分量作用，相邻峰轻易相互部分重合，交叉峰精细结构看不清楚，不便读出偶合常数。相敏COSY谱相位很复杂，相位调整质量直接影响偶合常数检测即信号灵敏度。在COSY谱中对角线与交叉峰相位总是相差90。。相敏COSY谱中，磁化转移地结果产生一对交叉峰相位相差180。以AX体系为例。其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散型。谱图黄色圆圈为正峰，红色为负峰。二维核磁共振谱讲义专家讲座第24页二维核磁共振谱讲义专家讲座第25页谱图正负峰以不一样颜色表示（下列图蓝色圆圈为正峰，红色为负峰）。也能够用实心表示正峰，空心表示负峰。其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散型从相敏COSY能够直接读出J值。这里需要识别主动偶合和被动偶合。所谓主动偶合就是相关交叉峰直接偶合。其余为被动偶合。主动偶合每一对峰总是一正一负。被动偶合交叉峰是相位相同（同为正或同为负）二维核磁共振谱讲义专家讲座第26页二维核磁共振谱讲义专家讲座第27页AMX二维核磁共振谱讲义专家讲座第28页4.LR-COSY(longrangeCOSY)常规1H-1HCOSY相关谱，观察不到较小远程偶合交叉峰。LR-COsY在COSY-90序列基础上引入较长延迟D2用于小J磁化转移，，能大大增加来自远程偶合交叉峰强度。其基本序列为：90。-t1-D2-α-ACQ(t2).在LR-COSY中总是包含有大偶合常数产生相干转移COSY交叉峰，正确选择D2能够衰减大J产生相关峰，有可能检测到4～5键质子间偶合（0.1～0.5Hz）.二维核磁共振谱讲义专家讲座第29页二维核磁共振谱讲义专家讲座第30页二维核磁共振谱讲义专家讲座第31页在解析LR-COSY中一定要将COSY与LR-COSY共同比较，确定哪些是大偶合，（2J，3J)哪些是远程偶合。二维核磁共振谱讲义专家讲座第32页与COSY相关试验自旋回波COSY(SECSY),双量子相干谱（DQC-COSY）,同核接力相干谱（RCT）.有兴趣同学，能够阅读相关书籍。二维核磁共振谱讲义专家讲座第33页二.天然丰度双量子13C谱INDEQUATE(13C-13C-COSY)这是二维碳骨架直接测定法，是确定碳原子连接次序试验，一个双量子相干技术。是一个13C-13C化学位移相关谱。在质子去偶13C谱中，除了13C信号外，还有比它弱200倍13C-13C偶合卫星峰，13C-13C偶合含有丰富分子结构和构型信息。因为碳是组成份子骨架，它更能直接反应化学键特征与取代情况。二维核磁共振谱讲义专家讲座第34页不过因为13C天然丰度仅仅为1.1%，出现13C-13C偶合几率为0。01％，13C-13C偶合引发卫线通常离13C强峰只有20Hz左右，其强度又仅仅是13C强峰1/200，这种弱峰往往出现在强13C峰腋部，加上旋转边带，质子去偶不完全，微量杂质影响等原因，使1JC-C测试非常困难。利用双量子跃迁相位特征能够压住强线，突出卫线求出JC-C,并依据Jc-c确定其相邻碳。一个碳原子最多能够有四个碳与之相连，利用双量子跃迁二维技术测量偶合碳双量子跃迁频率。13C-13C同核偶合组成二核体系（AX,AB）两个偶合13C核能产生双量子跃迁，孤立碳则不能。二维核磁共振谱讲义专家讲座第35页abcdefkabafibchfhfecdciedmhkhm二维核磁共振谱讲义专家讲座第36页二维核磁共振谱讲义专家讲座第37页它只有一个双量子跃迁，其频率正比于两个偶合13C核化学位移之和平均值。所以假如两个碳含有相同双量子跃迁频率，即能够判断，它们是相邻。在INADEQUATE谱图中F1与F2分别代表双量子跃迁频率和13C卫线，依次代表双量子和单量子跃迁频率。谱图中一个轴是13C化学位移，一个为双量子跃迁频率，其频率正比于两个偶合13C核化学位移之和平均值。所以谱图中F1=2F21斜线两侧对称分布着两个相连13C原子信号，表示碳偶合正确单量子平均频率与双量子频率间关系，水平连线表明一对偶合碳含有相同双量子跃迁频率，能够判断它们是直接相连碳。依这类推能够找出化合物中全部13C原子连接次序。二维核磁共振谱讲义专家讲座第38页二维核磁共振谱讲义专家讲座第39页18-->11-->16-->15-->17-->13.

二维核磁共振谱讲义专家讲座第40页三。NOESY（NuclearOverhauserEffectSpectroscopy)核间磁化传递是经过非相干作用传递，这种传递是靠交叉驰豫和化学交换来进行。即样品间偶极－偶极传递。它基本脉冲是：π/2-t1-π/2-tm-π/2-ACQNOESY基本序列在COSY序列基础上，加一个固定延迟和第三脉冲，以检测NOE和化学交换信息。混合时间tm是NOESY试验关键参数，tm选择对检测化学交换或NOESY效果有很大影响。选择适当tm,可在最终一个脉冲，产生最大交换，或建立最大NOE.NOESY谱图特征类似于COSY谱，一维谱中出现出现NOE两个核在二维谱显示交叉峰。NOESY能够在一张谱图上描绘出分子之间空间关系。二维核磁共振谱讲义专家讲座第41页二维核磁共振谱讲义专家讲座第42页COSYOFPBFNOESYofPBF

二维核磁共振谱讲义专家讲座第43页二维核磁共振谱讲义专家讲座第44页COSY二维核磁共振谱讲义专家讲座第45页CodeineNOESY6,7359101211二维核磁共振谱讲义专家讲座第46页Codeine在高场放大NOESY13’131818’161717’1114二维核磁共振谱讲义专家讲座第47页8-7,12

7-18,18'

3-5,10

5-11,16,18'

9-10,17,17'

10-16

11-18,16,14,18'

18-13,18'

16-14,17

13-14,17,17'

13'-17,17'

17-17‘TableofNOEs二维核磁共振谱讲义专家讲座第48页相敏NOESY与COSY类似，NOESY也适合用于相敏形式。在这种相敏谱上，分辨率高，轻易识别信号峰，而且谱线比非相敏形式谱线狭窄，从而限制了假峰产生，有效增加了灵敏度。二维核磁共振谱讲义专家讲座第49页phase-sensitiveNOESYofstrychnine.

二维核磁共振谱讲义专家讲座第50页四。TOCSY

TOCSY脉冲序列：是一个旋转坐标系试验（自旋锁定试验），自旋锁定是把COSY序列中第二脉冲以及NOESY序列中最终两个脉冲（包含混合时间），用一个长射频脉冲取代，把自旋沿着旋转坐标系一个锁定，在这种情况下不存在化学位移差，经过发生标量偶合磁化转移，造成了全部相关。TOCSY也有称之为HOHAHA.能够提供自旋系统中偶合关联信息。二维核磁共振谱讲义专家讲座第51页HOHAHA是经过交叉极化产生Hartmann-Hahn能量转移，从而观察较低旋磁比核一个方法。它是经过增加混合时间，使一个质子磁化矢量将重新分布到同一偶合网络全部质子，得到屡次接力信息。因为增加混合时间，灵敏度降低，为了处理这一问题，采取高分辨相敏方法，，交叉峰和对角峰都是吸收型，尤其适合用于含有独立自旋体系大分子，可深入判断证实COSY中因信号严重重合而造成不确定结果。选择适当参数可经过一次试验得到独立自旋体系全部质子相关信息。2d-HOHAHA特点是：经过改变t1测定，将同核Hartmann-Hahn跃迁信号沿化学位移二维展开，并用一个脉冲序列测得多重接力COSY。在复杂偶合体系1H信号归属于解析中，而且在肽类，核苷，蛋白质等发挥巨大作用。二维核磁共振谱讲义专家讲座第52页质子a,b,candd组成自旋体系既一个偶合网络系统,CH3CH2组成另外一个网络系统，这是两个独立自旋体系

，COSYspectrum,CH2a与CH2b.相关而在

TOCSYspectrum,它不但显示与质子b相关，而且也与itwouldalsoshowcorrelationsto两个（CH2）candd.相关。

二维核磁共振谱讲义专家讲座第53页TOCSYofcodeineCOSYTOCSY391012111816,13,14,13’183,163,53,163,953-103,103,5二维核磁共振谱讲义专家讲座第54页

TableofTOCSYpeaks:

('indicatesthemoreupfieldofgeminalCH2protons)8-->7

3-->5,9,10,16

5-->9,10,b11,16

9-->10,16,OH,H2O

10-->16,OH,H2O

11-->16,18,18'

18-->16,18'

16-->18'

13-->13',17,17'

13'-->17,17'

17-->17'二维核磁共振谱讲义专家讲座第55页4.3异核化学位移相关谱-HeteronuclearCorrelationofchemicalshift

所谓异核化学位移相关谱是两个不一样核频率经过标量偶合建立起来相关谱.应用最广泛是1H-13CCOSY.

1.1H-13CCOSY.常规1H-13CCOSY是指直接相连C-H之间偶合相关（1JCH）。二维核磁共振谱讲义专家讲座第56页基本脉冲：该试验关键是选择一个适合混合期，以使13C核和氢核信息充分转移，即选择适当⊿1⊿2。二维核磁共振谱讲义专家讲座第57页1H-13C-COSY谱图中F2为13C化学位移，F1为1H化学位移，没有对角峰，其交叉峰表明C-H偶合信息。解析时，能够从一已知氢核信号，依据相关关系，即可找到与之相连13C信号，反之亦然。能够从谱图中得到1JC-H结构信息。二维核磁共振谱讲义专家讲座第58页13C-1HCOSY2-丁烯酸乙酯二维核磁共振谱讲义专家讲座第59页ADCB二维核磁共振谱讲义专家讲座第60页7.78.157.47.5111.6120.6122.6127二维核磁共振谱讲义专家讲座第61页二维核磁共振谱讲义专家讲座第62页2.COLOC(CorrelationSpectroscopyvialongrangecoupling)和1H-13C-COSY序列基本一样，这是在COLOC谱中⊿1，⊿2对应于远程C-H偶合常数nJ(2JCH,3JCH),而不是1JCH.得到一键以上CH偶合相关信息，建立C-C之间关联，能够跃过N,O等其它官能团。成为推导结构归属信号，处理因为屏蔽效应难以处理季碳归属有力工具。因为该方法能够将季碳和相邻碳质子相关，对于确定C-C连接非常有效。二维核磁共振谱讲义专家讲座第63页常规1H-13C-COSY没有季碳和其它质子相关峰。COLOC谱图类似于C-H-COSY,两个坐标（F1,F2)是化学位移，交叉峰也类似于C-H-COSY，只是出现了小偶合相关峰。COLOC最大缺点是相关峰中包含全部1JCH信号。解析谱图时一定要对照C-H-COSY。确定1JCH,分辨出2JCH,3JCH.二维核磁共振谱讲义专家讲座第64页7.78.157.47.5127122.6120.6111.6ADCB二维核磁共振谱讲义专家讲座第65页7.78.157.47.57.78.157.47.5111.6120.6122.6127.07.7(d,1H,J=9.0,H-1),8.15(d,1H,j=8.8Hz,H-4)7.5(dd,1H,J=9.0,0.8Hz,H-3),7.4(dd,1H,8.8,1.2Hz,H-2)111.6(d,C-1),122.6(d,C-2),127.0(d,c-3),120.6(d,c-4)156.2(s,c-5),124.2(s.c-6)二维核磁共振谱讲义专家讲座第66页依据DEPT试验结果169.2,166.3,164.5都是季碳能够排出后四种可能。剩下下面四种二维核磁共振谱讲义专家讲座第67页由C(121.9)与H(6.61,2H,dd,J=2.4Hz),C(105.9)与H(6.61,2H,dd,J=2.4Hz)为同碳氢，得知C(121.9)与C(105.9)为苯环上处于间位两个叔碳，又因为此二碳都与酚羟基氢H(10.57,1H,s,OH)相关，故酚羟基不可能处于5位或8位。这么，只可能为两种结构：2，5-二甲基-7-羟基色原酮或2，8-二甲基-6羟基色原酮。

δH:2.27(3H,s,2-CH3),2.65(3H,s,5-CH3),5.98(1H,d,J=0.6Hz,H-3),6.61(2H,m,H-6,8),10.57(1H,s,7-OH）δC:169.2(C-2),116.1(C-3),183.7(C-4),146.9(C-5),121.9(C-6),166.3(C-7),105.9(C-8),164.5(C-9),119.6(C-10),24.7(2-CH3),27.8(5-CH3)二维核磁共振谱讲义专家讲座第68页4。4多量子跃迁谱常见核磁是选择⊿m=±1单量子跃迁。在偶极相互作用及其影响下，自旋体系能级不再由单一态波函数，而变成混合态，可能出现⊿m=0，±2，±3。。。跃迁，称之为多量子跃迁。多量子跃迁指是不满足选择⊿m=1跃迁。其中m表示体系总磁量子数，它们按照⊿m＝2称为n量子跃迁，而不问详细含几个跃迁。二维核磁共振谱讲义专家讲座第69页产生多量子跃迁不能直接观察到，要把它变回可观察单量子跃迁才能进行检测，得到S(t1,t2)后经过傅立叶变换得到频率谱。常见多量子跃迁谱有HMQC,HMBC.与1H-13CCOSY,COLOC谱相同，不一样是F1，F2坐标数据相反，。因为多量子相干转移，使其灵敏度大大提升。对于测定时间相等条件下所需样品量为：INADEQUATE200mg(400mM)1H-13CCOSY5~10mg(20mM)COLOC5~10mg(20mM)HMQC1mg(5mM)HMBC2~3mg(7mM)所以这两种方法为分子量大微量样品测定提供了辽阔前景。二维核磁共振谱讲义专家讲座第70页1。HMQC

(1-bondCHcorrelation)

1H检测异核多量子相干谱

HMQC是将1H信号振幅及相位分别依13C化学位移及1H间同核化学偶合信息调制，并经过直接检测调制后1H信号，取得13C-1H化学位移相关数据。它所提供信息及谱图与1H-13CCOSY完全相同。及图上两个坐标分别是1H,13C化学位移，直接相连13C与1H将在对应13C化学位移与1H化学位移交点处给出相关信号。不能得到季碳结构信息。二维核磁共振谱讲义专家讲座第71页HMQCofCodeine13CAssignment6