上海市结核病实验诊断操作规程

上海市结核病实验诊断操作规范（适用于非定点综合性医院）赵虎上海检验分会微生物学组主要内容结核病及其实验诊断的概述结核病实验诊断的管理要求结核病实验诊断的技术规范附录第一章结核病及其实验诊断的概述结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，目前全球有约20亿人被感染，每年新出现结核病患者约800-1000万，每年因结核病死亡人数约为200-300万。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。我国结核病年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其他传染病死亡人数的总和。结核病是我国重点防控的重大传染性疾病之一。第一节编写目的和应用范围根据我国的结核病防控体系，结核病的诊治工作主要在定点医院内进行。初次感染病人的症状往往不典型，存在轻症甚至无症状的结核病，老年人的结核病症状容易被其他疾病掩盖。这些病人的首诊医院往往不是定点医院。非定点医院的实验室人员一般未经过结核分枝杆菌检验的正规培训和能力认可，操作规程、方法和检测的能力各不相同，容易导致不正确的检验结果，使结核病的漏诊、误诊率增加。第二节结核病基础知识一、结核病定义和传播途径结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex,简称结核分枝杆菌）引起的慢性感染性疾病，可累及全身多个器官系统，最常见的患病部位是肺脏。传播途径主要是通过呼吸道传播。个体吸入含有结核分枝杆菌的飞沫后是否患病取决于吸入结核分枝杆菌的数量、毒力和个体的抵抗力等多种因素。二、结核分枝杆菌生物特性结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，引起人类结核病的主要病原菌是结核分枝杆菌。结核分枝杆菌大小为0.3-0.6

m×1-4

m，菌体细长而略弯，两端略钝。抗酸染色阳性是其重要特性。结核分枝杆菌生长缓慢，至少需要2-4周才出现可见菌落。结核分枝杆菌细胞壁富含脂质，约占细胞壁的60%，主要的成分是分枝菌酸和酸化海藻糖。前者是抗酸染色反应的物质基础；后者包括海藻糖双分枝菌酸和硫甘酸，分别具有介导肉芽肿形成和保护细菌在吞噬细胞内存活的作用，被认为是结核分枝杆菌的毒力因素。

三、检测分枝杆菌的临床意义

临床检测分枝杆菌的最终目的是为了辅助分枝杆菌感染患者的诊断及治疗。根据病人标本类型不同，所分离到分枝杆菌的临床意义也各不相同，实验室应尽快对病原菌做出鉴定，以确定其临床意义。（一）非结核分枝杆菌找到非结核分枝杆菌的临床意义取决于很多因素，包括：临床环境和宿主状态病原菌种类及其致病性分离培养标本的来源及其被污染的可能性被检出病原菌的数量（包括抗酸染色涂片）阳性培养的次数非结核分枝杆菌与临床疾病的关系非结核分枝杆菌菌种临床相关疾病 标本来源脓肿分枝杆菌或鸟分枝

患有囊性纤维变性或

呼吸道杆菌复合群（MAC）

支气管扩张的老年人 偶发分枝杆菌 食道贲门失弛缓症，慢性呼吸道

返流病，或矿物油摄入史 海分枝杆菌 有鱼缸或海水接触史的严重伤口活检/抽吸物堪萨斯分枝杆菌或MAC

毛细胞白血病，HIV感染史 血液，骨髓龟分枝杆菌，脓肿分枝

慢性免疫抑制药（如类固醇激素）杆菌或嗜血分枝杆菌 导致的浸润性皮肤损伤活检/抽吸物龟分枝杆菌，类龟分枝中央静脉导管，假肢，杆菌，偶发分枝杆菌或创口，脓肿分枝杆菌 注射部位，局部创伤 活检/抽吸物四、实验室检查结核分支杆菌检查是确诊结核病最特异的方法。（一）痰涂片优点：操作简便，价格低廉，能快速检测出感染性肺结核。缺点：直接涂片法灵敏度相对不高，要求每毫升痰标本中至少要包含5,000个杆状细菌才能检出阳性。肺外结核、HIV合并感染结核以及非结核分枝杆菌（NTM）感染的涂片灵敏度更低。限制因素：抗酸杆菌（AFB）涂片镜检不能区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌（NTM），也不能区分死菌与活菌、耐药与敏感菌株。（二）分枝杆菌培养优点：分枝杆菌的分离培养和菌种鉴定能为结核病患者提供最终的诊断依据，与涂片相比可显著提高阳性检出率（通常提高30%-50%）。分离培养同时也为药物敏感性试验提供实验菌株。缺点：操作更复杂，价格更昂贵，且菌体生长周期缓慢，并要求由专门的实验技术人员进行操作，用特殊的实验仪器进行培养，且所有实验必须保证在恰当的生物安全条件下才能开展。限制因素：样本在培养之前必须去污染，以抑制其他杂菌的生长。所有去污染的操作对分枝杆菌都有一定程度的伤害，因此，培养灵敏度不能达到100%。（三）基因检测及鉴定优点：在检测速度、操作标准化、潜在高流通量以及较低的生物安全要求等明显方面。2008年，WHO认证了用分子线形探针试验（LPAs）可以快速检测利福平耐药性（单独耐药或与异烟肼联合耐药）。缺点：进行LPAs试验仍需再做常规培养及DST。目前注册使用的LPAs方法只适用于对涂片阴性培养阳性或涂片阳性标本进行检测。限制因素：LPAs适合在中心实验室/国家参比室开展。如果地区实验室的基础设施能达到要求，也可考虑开展实验。第三节相关术语肺结核：意指肺内结核。粟粒性结核有肺部病灶者也归类为肺结核。肺外结核：包括结核性脑膜炎、心包膜结核、腹膜结核、脊椎结核、脊椎以外的骨与关节结核、肠结核、生殖泌尿系統结核，淋巴结核、皮肤结核；胸腔內的肺门或纵膈腔淋巴结核或单纯结核肋膜积液属肺外结核。痰涂片阳性肺结核（涂阳肺结核）至少一次痰涂片显微镜检查阳性、且医师判定胸部X光的病灶符合肺结核的变化、决定实施一个完整抗结核治疗的疗程；至少一次痰涂片显微镜检查阳性且该标本结核菌培养阳性。

相关术语痰涂片阴性肺结核（涂阴肺结核）定义一：至少三套痰标本涂片显微镜检查结果均为阴性；胸部X光病灶符合活动性肺结核变化；临床上对一周以上广谱抗生素治疗无反应（不包括使用抗结核药、氟喹诺酮或氨基糖苷类)；医师临床诊断为结核病并决定实施一个完整的抗结核治疗疗程。定义二：痰涂片检查阴性但痰培养阳性（涂阴培阳）医师临床诊断为结核病并决定实施一个完整的抗结核治疗疗程。相关术语耐药结核病（drug-resistanttuberculosis,DR-TB）：体外试验证实结核患者感染的结核分枝杆菌对一种或多种抗结核药物耐药。单耐药结核病（Monodrug–resistanttuberculosis,DR-TB）：体外试验证实结核患者感染的结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药。耐多药结核病（Multidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB）：体外试验证实结核患者感染的结核分枝杆菌至少对一线抗结核药物中的异烟肼和利福平耐药。广泛耐药结核病（Extensivelydrug-resistanttuberculosis,XDR-TB）：体外试验证实结核患者感染的结核分枝杆菌至少对一线抗结核药物中的异烟肼和利福平耐药外，还同时对卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素中的任一注射类药物和氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星中的任一氟喹诺酮类药物耐药。

相关术语第二章管理要求第一节实验室环境要求结核分枝杆菌大量活菌操作如抗原提纯、疫苗生产等须在符合生物安全三级（BSL-3）的环境中进行；结核样本检测，包括涂片、显微镜观察、样本的病原菌分离纯化、免疫学实验、PCR核酸提取等初步检测活动，可以在符合生物安全二级（BSL-2）的环境中进行；药物敏感性试验、生化鉴定建议在有负压的BSL-2环境条件下进行。

第二节实验室设备条件实验室硬件设置须包括但不限于：II级及以上生物安全柜、应急冲淋装置、显微镜、培养箱、冰箱、高压灭菌器、带生物安全罩杯的离心机等。各仪器设备要有使用记录，并按相应的要求定期校准维护。第三节人员要求需具备检验专业资质、经过上级实验室的结核分枝杆菌检验培训和生物安全培训并获得培训证书方可。必须能够正确使用生物安全柜等实验设备并懂得其基本原理。应清楚并遵循实验室各项工作安全条例，并接受实验室管理人员的监督。应收集实验室工作人员的本底血清并至少进行胸部X线检查，以后每一年复查一次，作好登记记录。必要时，实验室人员还应接受适当的、实验室中接触或可能接触病原的免疫接种或测试，并根据所接触的病原定期进行复查。患有严重疾病例如免疫缺陷或免疫抑制的工作人员不应进入实验室，未经过培训且合格授权的实验室人员不得进入实验室。第四节生物安全要求生物安全柜：实验室须配备II级或以上生物安全柜。易产生气溶胶的操作，如处理标本、涂片、动物实验等，均应在生物安全柜内进行。每次实验后必须开启紫外灯1-2小时对生物安全柜内进行物理消毒。定期擦拭并检查紫外灯的灯管，确保其有效的消毒效果。离心机：在离心感染性材料时，要把待检物放在密封离心管内，离心机在使用后须对其表面进行消毒。废弃物的处理实验室内所有可能被污染的废弃物品，如手套、实验室隔离衣等，在丢弃或重新使用之前，必须经过高压灭菌或含氯消毒液等消毒。所有实验用过的材料必须置于高压蒸汽灭菌器内，灭菌后方可丢弃。第五节质量管理要求一、室内质量控制-涂片镜检

每新进一批试剂及每次进行涂片染色检查时，需同时染色、阅读一张阳性及一张阴性涂片。涂片可预先准备，热固定后不染色，4℃储存于密闭的容器内。用临床标本离心沉淀制备的涂片质控片最佳。如无临床标本，也可使用戈登分枝杆菌制备阳性质控片，大肠埃希菌制备阴性质控片。定期记录、审核涂片结果，出现下列情况时需要注意：指定病人人群的阳性及阴性涂片率升高；不同病人标本出现连续涂阳；涂阳标本无分枝杆菌生长涂阴标本固体培养基上分枝杆菌生长，2+或以上。室内质量控制-涂片镜检实验室要有成文的质控程序，需记录所有QC试验的结果。失控时，应有恰当的纠正措施，并记录结果。所有培养基和试剂需要记录批号、有效期。购买的商品培养基，实验室需保存供应商提供的相应培养基QC。实验室可建立不同检验结果参数的正常平均值，定期监测这些参数以控制实验过程的质量。

室内质量控制-培养固体药敏试验：培养基质量控制：需监控培养基的外观、颜色、质地、凝固性、均质性。含药培养基无菌试验，采用同一批次的不含药培养基抽取5%进行无菌性测试。药物纯粉：药敏试验应使用厂家提供的药物标准粉或纯粉，并从厂家获得药粉的效价和纯度。含药培养基保存：培养基应在冷藏环境下置于密封袋内保存，保存期空白培养基不超过2个月。异烟肼可室温保存，链霉素、乙胺丁醇、卡那霉素、丁胺卡那应冷藏保存，卷曲霉素和利福平应冷冻保存。商业化液体药敏试验：遵循商家说明书进行。室内质量控制-药敏试验二、室间质量评估

结核病实验室所有临床服务项目每年应当参加卫生部、上海市临床检验中心或上海市疾病预防控制中心组织的相关的能力验证和/或室间质评项目，且须符合要求，如无以上项目，可采用实验室间比对来判定分析试验的可靠性，每年至少两次。痰涂片镜检结果质量要求，涂片阴性符合率95%以上，涂片阳性符合率98%以上，总符合率96.5%以上。“1+”以上的阳性涂片不允许出现假阴性。第三章技术规范第一节基本技术要求

该部分内容系结核分枝杆菌检验基本技术，适用于非定点医院结核检测实验室。一、标本采集、运送及贮存

痰液：收集患者深部咳出痰置于无菌容器中（最小量3ml）。1h不能送检，冷藏。血液：无菌方法采集10ml全血（成人最少量为5ml,儿童1ml）。不宜冷藏冷冻。体液：无菌方法采集10ml～15ml液体于无菌管中。液体量尽量多，不要用棉签蘸取体液送检。1h不能送检，冷藏。脓液标本：1h不能送检，冷藏。深部脓液：采用无菌方法，用注射器抽取脓液和/或采集组织。开放性损伤标本：应尽可能从溃疡基底部或边缘部采集，无菌采集组织标本。二、病原学检测方法（一）涂片染色-样本准备

一张载玻片上只能涂抹一份标本。每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于涂片检查。应使用以95％乙醇擦拭（或浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在载玻片一端有磨砂面上用铅笔在上面直接书写病人姓名、标本送检日期、标本检验号。在生物安全柜中小心打开承载标本的容器，防止产生气溶胶或标本外溢。直接涂片法样本准备

用折断的竹签茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分约50～100μl，于玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成2cm×1cm椭圆、厚薄适度的涂片，置于烤片机上烘干，备染色用。涂片染色-样本准备离心沉淀法样本准备高压浓缩：将标本放入10ml耐高压带螺旋口的无菌管中，1:1加入生理盐水。121℃高压20分钟。将标本管放入带内盖的离心机中，3000g离心15分钟后，取沉淀涂片。涂片都须放在生物安全柜中40±5℃烤片机上烘干固定，时间≥1小时。溶痰剂浓缩：将溶痰剂与痰液按约（1～3）：1的比例加入痰瓶中，竹签打匀，至痰中黏液完全液化，浊度为1个麦氏单位左右。3000g，离心10min，弃去上清液，取沉淀物50-100μl制成2cm×1cm椭圆、厚薄适度的涂片，置于烤片机上烘干备用。涂片染色-样本准备萋尼抗酸染色程序（冷染）

加石碳酸复红溶液，盖满痰膜，染色5分钟或更久（不需加温步骤，染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液）。水洗（之后尽可能将水分沥干或以滤纸吸干）。加酸性酒精溶液，脱色2分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至标本无可视红色为止水洗。加亚甲基蓝溶液染色30秒，水洗、干燥。镜检（300个视野）。一张合格的染色玻片，由于被亚甲兰染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表明该玻片过厚。（二）涂片染色-萋尼染色萋尼抗酸染色程序（热染）抗酸性杆菌胞壁含有类脂质，一般不易着色，用强染剂（5%石炭酸复红溶液）加温或延长染色时间，可使其着色，并不易为盐酸酒精所脱色，使菌体染成红色。非抗酸菌易为盐酸酒精脱色，再以美兰复染使呈蓝色，以此区分。涂片染色-萋尼染色结果判读抗酸杆菌阴性（-）连续300个不同视野未发现抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（+）报告抗酸杆菌数：1-8条/300视野。抗酸杆菌阳性1＋：3-9条／100视野；抗酸杆菌阳性2＋：1-9条/10视野，连续100个视野；抗酸杆菌阳性3＋：1-9条/每个视野；抗酸杆菌阳性4＋：≥10条/每个视野。注：1）报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察100个视野，3+、4+时至少观察50个视野。

2）如果1－2条/300视野，建议再送一份样本进行检查。涂片染色-萋尼染色质量控制建议一名镜检人员每天的涂片阅读量25张左右。采用自查和互查方式，至少抽查10%涂片，并填写室内质控登记表。每次染色应同时进行阳性质控和阴性质控。涂片染色-萋尼染色痰涂片的保存根据结核病细菌学实验室登记本记录，按照弃旧存新的原则，保存近期3个月的全部痰涂片待复检。年涂片量不足500张的实验室，必须保存全年的涂片待复检。如果近3个月的涂片数超过1000张，可以按照弃旧存新的原则，保存近期1000张待抽查复检。涂片染色-萋尼染色涂片染色—荧光染色特点和原理荧光染色法将抗酸杆菌于黑色或暗红色背景下染成橘黄色的菌体，较易于观察。荧光染色的涂片应于24小时内镜检，否则荧光可能会消失。荧光染色阳性者需经抗酸染色确认。操作步骤加入荧光染剂(auramineO或auramineO-rodamineB-phenol)，覆盖整个涂片，静置15分钟（不必加滤纸和加热）。以蒸馏水或去离子水冲洗（所用的水不可含氯，因为氯会干扰荧光的产生）。加入酸性酒精覆盖整个涂片，脱色约两分钟，以水冲洗。加入高锰酸钾溶液，覆盖整个涂片复染约两分钟。时间不能过长，否则荧光会消失。冲净，干燥。涂片染色—荧光染色镜检与报告抗酸杆菌阴性（－）：连续观察50个不同视野未见抗酸杆菌阴性（±）：连续观察50个视野内仅发现1～3条，为可疑结果，报告实际条数。抗酸杆菌阳性（1＋）：10～99条／50个视野抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条／每个视野抗酸杆菌阳性（3＋）：10～99条／每个视野 抗酸杆菌阳性（4＋）：≥100条／每个视野涂片染色—荧光染色质量控制自查和互查：抽查复检当日10%涂片，在抽查的流水号旁边签名。要求：不允许1+以上的阳性片出现假阴性。涂片脱落面积应在10%以下。每次染一张抗酸染色阳性质控片和阴性对照。涂片染色—荧光染色（二）分枝杆菌培养-标本前处理NaOH-NALC法（N-乙酰-L半胱氨酸+NaOH）痰液和肺泡灌洗液取5-10ml标本到50ml带有螺旋盖的离心管内。加等量的NaOH-NALC溶液，盖紧盖子后漩涡振荡至液化。室温静置15-20分钟，勿超过20分钟，以防杀死分枝杆菌。添加PBS至50ml刻度线，盖紧盖子，颠倒混匀。离心3000g15分钟。静置5分钟后把上清液倒至含有消毒剂的容器内。添加1-2mlPBS，制备成混悬液。取适量混悬液进行接种及涂片检查。处理后样本中NaOH终浓度1%－1.5%。分枝杆菌培养-标本前处理无菌体液脑脊液、胸腹水和关节液等体液标本都是无菌采集的，当采集的标本量较少，可以直接接种培养基；标本量>10ml时，以3000g的速度离心15分钟后取沉淀物接种。如果标本存储时间较长，应对这些标本进行轻微去污处理。用5ml生理盐水使沉淀物重新悬浮，然后按照与痰标本相同的程序进行去污处理。如果标本比较粘稠，在离心之前添加50mg的NALC，使标本液化。分枝杆菌培养-标本前处理胃液和尿液胃液标本由于pH值较低，如不能及时处理（标本采集后4小时内），应用NaOH溶液中和后储存。对胃液和尿液标本离心集菌处理后，用5ml生理盐水使沉淀物重新悬浮，然后按照与痰标本相同的程序进行去污处理。分枝杆菌培养-标本前处理粪便取适量成形粪便标本或1～5ml的液体标本于无菌离心管内，加10毫升无菌生理盐水，振荡30秒，室温静置15分钟，取7～8ml上清液到50毫升的离心管内。随后处理同痰标本。分枝杆菌培养-标本前处理NaOH-NALC法标本前处理注意事项使用NaOH-NALC进行消化时，不要过度摇动试管。过度的振荡将导致NALC被氧化，以致失效。如果标本中含有血液，则不能使用NaOH-NALC法，因为NALC在有血的环境中不起作用，应使用NaOH方法。高速离心过程中温度升高，直接影响分枝杆菌的活力，导致阳性率降低和检测时间延长，建议使用低温带生物安全罩杯的离心机。分枝杆菌培养-标本前处理NaOH法取5-10ml痰或其他标本到50ml带有螺旋盖的离心管内。添加等量的NaOH溶液，漩涡振荡5-20秒。室温静置15-20分钟。添加PBS至50m