病毒的分离鉴定

病毒的分别与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必需满足以下原则：①从患病者体内分别出病毒；②在试验动物或寄主细胞中可以培育；③证明这种培育物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重分别出病毒。病毒的分别标本的处理标本的收集5g50mlPBS20-25颗玻璃小100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000Xg,4C心6min。拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培育基中，将棉拭子中的3000Xg4C30min。组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时参加足量的PBS20%的悬液，3000Xg4C30min。除菌处理a〕10000单位/4Cb〕鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2023单位/4C4小时。精选文库精选文库C〕对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可参加等量的乙醚4C病毒的分别培育病毒是严格的细胞内寄生微生物，培育病毒必需使用细胞。依据病毒的不同选用敏感动物〔动物接种〕、鸡胚〔鸡胚接种〕或离体细胞进展分别培育〔细胞培育〕。鸡胚接种 鸡卵的选择：一般都选颖、10天以内的受精卵以保证规格质量上的全都。孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进展，气室向上，孵育的最适温38--39C40—708日后，鸡卵应每天1—2次，以帮助鸡胚发育均匀和防止鸡胚膜粘连。C 4〜5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育状况〔二〕天一次〕。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡4天后，在检卵器上就可见到清楚的血管，鸡卵内有一小黑点〔鸡胚〕，有明显的自然转动。③死胎：假设觉察鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可推断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。

1.鸡胚卵黄囊接种：用5〜8天鸡胚，以瘦长12〜囊膜检查胚,常用于某些羊膜腔病毒育分取羊水检查。常用干流感病毒的初次分别。精选文库精选文库3图3.图3.尿囊腔接种9〜12天鸡弗賈0胚，将标本接种于尿囊腔，腮腺炎病毒等。4.10〜l2天amme)剖检及收获14C过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒,将气室处卵壳剥去〔不要将碎片落入壳膜〕。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，〔切勿压破卵黄囊〕再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。f〕优缺点优点：技术简洁、来源充分、价格低廉、数量可大、不需特别设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。122细胞培育细胞培育〔cellculture〕是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或2〜4个细胞团悬液进展培育。依据细胞的精选文库精选文库4类型和培育细胞代数的不同，可将其分为两种：原代细胞培育；传代细胞培育。组织细胞培育的病毒，当消灭稳定的细胞病变后，就可取培育液或培育液与细胞培育物混和物，细胞培育物中的病毒可承受冻融、超声波等方法使其释放出来。优点:每个细胞生理特性根本全都，对病毒易感性相等;无个体差异，准确性和重复性好;C)可严格执行无菌操作;细胞培育本身就能显示病毒的生长特征;应用空斑技术可进展病毒的克隆化。病毒的鉴定形态学鉴定细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)：病毒在细胞内增殖后,可引起细胞的不同变化。常见的形态学转变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落。CPE消灭的时间是鉴定病毒的标志之一。某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在一般光学显微镜F可见胞浆或胞核内消灭的呈嗜酸性或嗜碱性染色、形或不规章形的团块状构造，病毒学上称为包涵体。血吸附和血凝作用

大小数量不等的圆多见于以出芽方式释放的病毒。血吸附指感染细胞具有吸附红细胞的力量；血凝作用指感染细胞的培育液中有很多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用。221血吸附试验具有血凝力量的病毒能使感染的细胞吸附红细胞， 这种现象被称作吸附作用。大多数粘液病毒能引起吸附。具体检验步骤如下:PBS10%的豚鼠红细胞悬液，4C0.5%的浓度〔10%1ml19mlPBS混匀〕。吸去比照和试验管培育细胞的上清液，试验管的上清液留待电镜观察。C 0.2ml红细胞悬液，4C30min4CPBS清洗〕3次。显微镜下读取结果并记录，依据吸附红细胞的量可分为0〔阴性〕~4〔完全吸附〕级。37C60min,有神经氨酸酶的病毒将会从红细胞上游离下来。2.2.2血凝试验1~1250al生理盐水。150al50al2L,如此倍比1050al;最终两孔〔11、12〕为红细胞比照。C)1%1~1250al。d)手工震荡，37C30min〔40min〕后观看结果。电子显微镜检查病毒的很多特征如大小、形态、构造等必需借助电子显微镜进展检查。对于目前尚难培育而形态又格外典型的病毒， 可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培育收获的材料作电子显微镜检查，直接观看病毒粒子。7〔戊二醛/四氧化锇〕77透、包埋与聚合77〔铀染/铅染〕a〕优点：可观看病毒形态和形态发生过程。b〕缺点：操作简单，费时，但标本可长时间保存。负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的积存而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。具体步骤〔漂移法〕为：现将需负染的样品滴几滴在干净的载玻片上，再将有支持膜的载网漂移在样品液滴上以沾取样品，用滤纸吸干样品余液使样品在载网上仅有一薄层液膜，在样品未干时即加一滴复染液的铜网上，用滤纸吸干多余的染液即可。a〕优点：快速简易〔10-20min〕;区分率高；图象清楚地病毒构造。b〕107以上；全部样品应处于悬浮状态。血清学试验ELISA、琼脂集中、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长状况和发病组织中的病毒抗原。241中和反响利用病毒与特异性中和抗体结合的特性鉴定病毒的种类， 观看特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。2.4.2酶联免疫吸附试验 〔ELISA〕将