紫外可见分光光度法（食品仪器分析课件）

光的性质

紫外—可见分光光度法是利用物质对紫外—可见光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量分析的一种仪器分析方法。特点：灵敏度和准确度较高，仪器设备简单，操作方便，应用广泛等。一、光的波动性光是一种电磁波，电磁波可以用周期T(s)、频率ע(Hz)、波长λ(nm)和波数σ（cm-1）等参数描述。它们之间的关系为：

ע=1/T=c/λ

σ=1/λ=ע/c波谱区名称波长范围跃迁能级类型分析方法

射线0.005nm~0.14nm原子核能级放射化学分析法X射线0.001nm~10nm内层电子能级X射线光谱法光学光谱区远紫外光10nm~200nm内层电子能级真空紫外光度法近紫外光200nm~400nm价电子或成键电子能级紫外分光光度法可见光400nm~750nm价电子或成键电子能级比色法、可见分光光度法近红外光0.75μm~2.5μm分子振动能级近红外光光谱法中红外光2.5μm~50μm分子振动能级中红外光光谱法远红外光15μm~1000μm分子转动能级远红外光光谱法微波0.1cm~100cm电子自旋、分子转动能级微波光谱法射频(无线电波)1m~1000m电子和核自旋核磁共振光谱法二、光的粒子性光具有粒子性，光是由光子组成的，光子具有能量，其能量与频率或波长的关系为：

E=hע=h·c/λh=6.626x10-34J·s三、单色光、复合光和互补色光同一波长的光称单色光，由不同波长组成的光称复合光。物质有色是因其分子对不同波长的光选择性吸收而产生。下表列出颜色与吸收光之间的关系。其中对应颜色的光称互补色光。不同颜色的可见光波长及其互补光红650～760绿蓝橙610～650蓝黄580～610紫黄绿560～580红紫绿500～560红蓝绿490～500橙绿蓝480～490黄蓝450～480黄绿紫400～450互补光颜色

/nm蓝绿

互补色光和各种颜色光的波长范围，可作为光度测定时选择测量波长的参考蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿图中处于对角线上的两种单色光为互补色光。例如蓝色光和黄色光、绿色光和紫红色光互补等光谱吸收曲线一、紫外-可见吸收光谱产生的机理光子作用于物质分子时，如果光子的能量与物质分子的电子能级间的能级差满足

△E=hע

光子将能量传递给物质分子，分子获得能量可发生电子能级的跃迁。在光吸收过程中基于分子中电子能级的跃迁而产生的光谱，称为紫外-可见吸收光谱（或电子光谱）。二、吸收曲线

若以不同波长的光照射某一溶液，并测量每一波长下溶液对光的吸收程度（即吸光度A），以吸光度为纵坐标，相应波长为横坐标，所得A-λ曲线，称为吸收曲线。它更清楚地描述了物质对光的吸收情况。四种不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线

任何一种溶液对不同波长光的吸收程度是不一样的。

三、吸收曲线的特征1.同一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax

。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。2.同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似λmax不变。在λmax处，吸光度A正比于浓度C。测定最灵敏。3.不同物质吸收曲线的特性不同。

吸收曲线的特性包括曲线的形状、峰的数目、峰的位置和峰的强度等。它们与物质特性有关，吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。物质对光的选择性吸收一、光的吸收物质粒子如原子、分子、离子等总是处于特定的不连续的能量状态，各状态对应的能量称为能级，用E表示。基态E0

，激发态Ej

EL=hע=△E(能级差)二、物质颜色的产生

物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生的。白光青蓝青绿黄橙红紫蓝

一种物质呈现何种颜色，与入射光组成和物质本身的结构有关,而溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的吸光质点(离子或分子)选择性地吸收某种颜色的光而引起的。常见的有下列三种情况：①当白光通过某一均匀溶液时，如果各种波长光几乎全部被吸收，则溶液呈黑色。完全吸收光谱示意表观现象示意复合光②如果入射光全部透过（不吸收），则溶液无色透明。完全透过③如果对某种色光产生选择性吸收，则溶液呈现透射光的颜色，即溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。如硫酸铜溶液选择性地吸收了白色光中的黄色光，所以呈现蓝色。吸收黄色光朗伯-比尔定律当一束平行单色光，通过一均匀的溶液后，光的强度会减弱。I0=Ia+It入射光强度吸收光强度透过光强度一、基本概念透光度T

（透射比）Transmittance定义透光度：T取值为0.0~1.0全部吸收~~~~全部透射A=lg(1/T)=-lgT吸光度A(Absorbance）A取值为0.0~∞全部透射~~~~全部吸收二者关系为：定义吸光度：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即

A=κbc

式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。K可用a（吸光系数）或ε（摩尔吸光系数）表示。c为吸光物质浓度，b为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。二、朗伯-比尔定律朗伯和比尔分别研究了吸光度与液层厚度和吸光度与浓度之间的定量关系，合称朗伯-比尔定律，其数学表达式为：吸光度吸收层厚度(cm)吸光质点浓度A=lg(I0/It)=κbc

物理意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比——分光光度法定量分析的理论基础比例常数的取值与浓度的单位有关

比例常数入射光波长物质的性质温度三、吸光系数A=kbc①当c的单位为g·L-1时，比例常数用a表示，称为质量吸光系数

A＝abρ②当c的单位用mol·L-1时，比例常数用ε表示,称为摩尔吸光系数

A＝

εbca

的单位:L·g-1·cm-1

ε的单位:L·mol-1·cm-1ε=MaM—物质的摩尔质量摩尔吸光系数的物理意义：溶液浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时物质对光的吸收程度（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数（2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸光物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示

εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力。四、朗伯-比尔定律的应用条件朗伯-比尔定律不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下，各组分吸光度具有加和性

A=A1+A2++An（1）入射光必须为单色光（2）被测样品必须是均匀介质（3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相互作用。偏离朗伯一比尔定律的原因

定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲。一、比尔定律的局限性

比尔定律假设了吸收粒子之间是无相互作用的，因此仅在稀溶液（c<10-2mol/L)的情况下才适用。在高浓度时，由于吸光物质的分子或离子间的平均距离减小，是相邻的吸光粒子的电荷分布互相影响，从而改变了它对光的吸收能力。

吸收定律成立的前提条件之一是入射光为单色光，但实际上难以获得真正的纯单色光。

在实际工作中，为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。

分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，而复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。二、非单色光引起的偏离三、溶液本身发生化学变化

溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。当溶液浓度c>10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

2CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。例：显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：

Fe(SCN)3

Fe3++3SCN－溶液稀释时一倍时，上述平衡向右，离解度增大。所以Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致朗伯—比尔定律偏离。紫外-可见分光光度计的组成一、光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。返回氙灯氢灯钨灯二、单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。

棱镜:玻璃350～3200nm,石英185～400nm

光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨率高,使用方便棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同单色器入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400

光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.三、吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池，有0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等规格。紫外区：石英池四、检测器：利用光电效应，将光能转换成电流信号。 光电池，光电管，光电倍增管h

（片）红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nm五、指示器（数据处理）低档仪器：刻度显示

中高档仪器：数字显示，自动扫描记录紫外-可见分光光度法定量分析一、单组分的定量分析1、吸光系数法（绝对法）2、标准对照法（直接比较法）

As=kbCsAx=kbCsCs=AsCx/Ax3、标准曲线法配制一系列浓度不同的标准溶液，分别测定其吸光度，用吸光度对浓度作图。再测定未知液的吸光度Ax，从工作曲线上查得其浓度。cAAxcx二、多组分的定量分析a不重叠b重叠紫外-可见分光光度法定性分析一、未知化合物的定性鉴定每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。在相同的实验条件（仪器条件、溶剂）下，将未知物的紫外光谱与标准物质的紫外光谱进行比较，若两者谱图相同，可认为含有相同的生色团，但不一定是相同的物质。二、纯度的鉴定用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如苯256nm处有B带，而甲醇乙醇无吸收带，可鉴定其纯度。三、结构分析紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。紫外-可见分光光度法测定条件的选择一、选择适当的入射波长一般应该选择λmax为入射光波长。但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。二、吸光度范围的选择

仪器光源不稳定、实验条件的偶然变动、读数精度变动等都会带来测量误差。光度分析误差化学因素仪器因素浓度测量的相对误差与T(或A)的关系：仪器读数误差对于给定的仪器，读数误差ΔT为一常数1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434实际工作中，应控制T在15～65％,A在0.2～0.8之间(调c,b,

)

因此，在不同的吸光度范围内仪器读数对测定带来不同程度的误差，根据计算结果作图三、仪器狭逢宽度的选择狭逢宽度过大，入射光的单色性降低狭逢宽度过小，光强变弱。在不引起吸光度减小的情况下，尽量选取最大的狭逢宽度。四、参比溶液的选择

吸光度的测量：将被测溶液盛放在吸收池中，放入分光光度计光路中。如图所示：MR吸收试样中其他成分吸收溶剂和试剂吸收吸收池对光的反射和吸收A=lg(I0/It)

目的是为了消除由于比色皿、溶剂及试剂对入射光的反射和吸收等带来的误差。A（参比）=A（干扰）+A（池）=0

为了使吸光度真正反映待测组分的浓度，需扣除非待测组分的影响——使用参比溶液

参比溶液：将不含待测离子的溶液或试剂加入一比色皿中，试液放入另一比色皿中，再调节仪器，使不含待测离子溶液处于T=100%（A=0）处，此种溶液为参比溶液。A（样品）-A（参比）=

A（MR）=kbc

参比溶液的选择（1）如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂（或蒸馏水）作参比溶液（2）如果显色剂或其他试剂略有吸收，应用空白溶液（包括显色剂或其它试剂不加待测试样溶液）作为参比溶液。（3）如试样中其它组分有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作为参比溶液；当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。紫外-可见分光光度法干扰及消除方法

共存离子有色或显色剂反应生成有色物质干扰测定，需设法消除或提前分离出来。

消除方法有：一、控制酸度二、选择适当的掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。

例：测定Ti4+，加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为［Fe(PO４)2］3-(无色)，消除Fe3+的干扰。三、利用惰性配合物四、选择适宜的波长避开干扰物的最大吸收，配制适当的参比液，消除干扰组分的影响。五、分离干扰离子采用适当的分离方法预先除去干扰物质。紫外-可见分光光度法显色反应条件的选择

可见光区的吸光光度分析，首先要利用显色反应将待测组分转变为有色物质，然后进行测定。显色剂：将待测组分转变为有色物质的化学试剂M+R