海洋细菌抗菌筛选及深海独岛枝芽胞杆菌分离鉴定

海洋细菌抗菌筛选及深海独岛枝芽胞杆菌分离鉴定

在过去的几十年里，人们从海洋微生物中分离了许多生物活性物质，并极大地扩展了新活性物质的来源。Hotta等相对于陆地微生物,海洋微生物生活在非常特殊的环境中,其代谢产物的多样性和代谢途径的独特性决定了海洋微生物次级代谢产物具有新颖的结构和特异的生物活性。生活环境特殊、种类复杂等特点赋予海洋微生物更好的抗菌活性和产生更多新型抗菌活性物质的能力作者在此从海洋微生物中筛选得到具有抗植物病原菌作用的菌株———深海独岛枝芽胞杆菌A493(VirgibacillusdokdonensisA493),对其进行抗菌活性物质的分离鉴定研究。1实验1.1微生物菌种(1)拮抗细菌指示菌:水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.CarotovoraBergeyetal.)、埃希氏杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、恶臭假单胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)、荧光假单胞菌SBW25(PseudomonasfluorescensSBW25)、荧光假单胞菌Pf0-1(PseudomonasfluorescensPf0-1)、丁香假单胞菌DC3000(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000)、黄色海假单胞菌(Pseudomonasxanthomarina)、浅黄色假单胞菌(Pseudomonasflavescens)、盐单胞菌(Halomonassp.),其中恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌由美国农业部根病生物防治实验室Weller教授提供;丁香假单胞菌DC3000由南京农业大学郭坚华教授提供;其余菌株由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室菌种保藏中心(CCAM)提供。(2)农作物病原真菌指示菌:意大利青霉(PenicilliumitalicumWehmer)、稻梨孢菌(PyriculariaoryzaeCav.)、立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniHuhn.)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)、核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary]、奇异长喙壳菌[Ceratocystisparadoxa(Dade)Mereau]、玉蜀黍赤霉[Gibberellazeae(Schw.)]、灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)、玉蜀黍平脐蠕孢菌[Bipolarismaydis(NisikadoetMiyake)Shoeml]、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae),以上菌株由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室菌种保藏中心(CCAM)提供。(3)海洋菌株共计411株,由中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)提供。国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室鉴定并提供深海独岛枝芽胞杆菌(Virgibacillusdokdonensis)A493(MC-CC1A00493)。该菌分离自东太平洋多金属结核区,采集深度4754m,站点:ES0304。1.2材料的ndf-lpda(1)海洋细菌培养基(2216e):蛋白胨10g,酵母粉5g,牛肉浸粉1g,乙酸钠1g,硝酸铵0.2g,柠檬酸钠0.5g,柠檬酸铁0.1g,人工海水定容至1L,pH值7.6±0.2。人工海水配方:氯化钠19.45g,氯化镁0.75g,硫酸镁0.75g,氯化钙1g,氯化钾0.55g,碳酸氢钠0.16g,溴化钾0.08g,氯化锶34mg,硼酸22mg,硅酸钠4mg,氟化钠2.4mg,磷酸氢二钠8mg,氯化锰0.5mg,硫酸铜0.5mg,硫酸锌10mg,纯水定容至1L。(2)植物病原菌培养基(PDA):马铃薯200g,蔗糖20g,蒸馏水1L。(3)细菌培养基(LB):胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl5g,蒸馏水1L。(4)水稻黄单胞菌培养基(协本氏培养基):马铃薯300g,蔗糖15g,十二水合磷酸氢二钠2g,四水合硝酸钙0.5g,蛋白胨5.0g,蒸馏水1L。以上均为液体培养基,加1.5%琼脂粉配制相应固体培养基。1.3方法1.3.1海洋抗细菌筛选1.3.1.植物病原菌保鲜以水稻黄单胞菌、意大利青霉、稻梨孢菌、灰葡萄孢菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、大丽轮枝菌和胡萝卜软腐欧文氏菌等7种植物病原菌为指示菌。水稻黄单胞菌采用协本氏液体培养基制作菌悬液,其它病原菌采用接琼脂菌块法接入带有玻璃珠的PDA液体培养基中制作菌悬液。1.3.1.培养条件及温度采用2216e标准培养基,250mL锥形瓶中装液量为50mL,培养时间为48h,培养温度为28℃(个别嗜热细菌采用60℃)。1.3.1.海洋细菌抑制效果测定采用打孔平板对峙法。吸取100μL水稻黄单胞菌等悬液,均匀涂布相应固体琼脂培养基平板,然后在培养基上用5mm直径打孔器均匀打孔6个,挑出琼脂块备用。精确吸取不同海洋细菌发酵液50μL,分别加入到琼脂平板已经制备好的孔中,观察抑制效果。病原细菌培养24h、病原真菌培养48h,每株菌液3组重复。1.3.1.4-抗感菌复筛选将初筛得到的潜在拮抗菌株的发酵液于4℃、8000r·min1.3.1.水稻黄单胞菌回复突变试验对复筛得到的菌株进行抗菌谱测试,抗菌测试针对数十种植物病原细菌和真菌进行,以期发现具有特异抗菌谱的活性物质。具体测试采用牛津杯法:吸取100μL水稻黄单胞菌等悬液,均匀涂布相应固体琼脂培养基平板,待涂抹均匀晾干后取2个灭菌牛津杯对称放入平皿中,一个加入100μL无菌水作为对照,另外一个加入100μL温度处理后的无菌发酵上清液。每组重复3次。1.3.2a493温室的生活试验1.3.2.种子的处理水稻种子先用75%乙醇浸泡30s,然后用1%升汞处理15min,最后用无菌水清洗3次。在灭菌的玻璃平皿中铺上一层灭菌滤纸,将处理好的水稻种子整齐地放置在上面,28℃保持湿润。待水稻种子发芽后转入直径20cm的装有4000g灭菌土的盆中,每盆栽种6株。1.3.2.离心除菌准备将水稻黄单胞菌采用协本氏液体培养基活化后,离心取菌体沉淀,无菌水稀释至终浓度为10A493在优化条件下,发酵成熟后,离心除菌取上清液,即得A493样品,备用。1.3.2.保鲜剂接种病原菌采用剪叶片法接种病原菌。待水稻生长到第5片叶片时用蘸有菌液的灭菌剪刀剪去第5片叶尖1cm长度来接种水稻黄单胞菌。接种病原菌后第2d喷洒A493样品1次(每盆喷洒15mL),20d后观察实验情况。实验分为3组:(1)不接水稻黄单胞菌喷洒清水处理;(2)接水稻黄单胞菌喷洒清水处理;(3)接水稻黄单胞菌喷洒A493样品处理。每组3盆重复,共9盆,每盆6株水稻。通过比较病斑面积(L)和叶片总面积(W)来评价防治效果1.3.3重要物质amba93的分离、精制和鉴定1.3.3.菌株活化、培养将保存于甘油管的A493划线平板活化,挑取单菌落接种于装有50mL2216e培养液的250mL三角瓶中,28℃、180r·min1.3.3.2.提取活性物质取1L发酵液8000r·min1.3.3.deea-65型弱碱性阴离子交换填料第一步:采用CM-52型弱酸性阳离子交换纤维素分离。CM-52阳离子交换填料用pH值8.0的0.2mol·L第二步:采用DEAE-52型弱碱性阴离子交换纤维素分离。DEAE-52阴离子交换填料用pH值6.0的0.2mol·L1.3.3.活性条带的制备第一次分离:展开液采用甲醇∶氯仿∶浓氨水=4∶2.2∶3.2,加入层析缸后预饱和30min。点样位置距离硅胶板下层1cm处,展开剂展开3h,通过0.3%水合茚三酮(0.3g茚三酮,97mL正丁醇,3mL乙酸)显色得到分离的各个条带。经过大量点板收集条带,分别切胶后用甲醇溶解回收,然后用氮气吹干甲醇,用水溶解,测试活性。每组实验重复3次。第二次分离:将第一次分离得到的活性条带浓缩制样。展开液采用正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1,加入层析缸后预饱和30min。点样位置距离硅胶板下层1cm处,展开剂展开7h,通过0.3%水合茚三酮显色得到分离的各个条带。经过大量点板收集条带,分别切胶后用甲醇溶解回收,然后用氮气吹干甲醇,用水溶解,测试活性。每组实验重复3次。1.3.3.5.苯磺酸固相萃取、柱净化将SupelcleanLC-SAX型固相萃取小柱先后用5mL甲醇和5mL水清洗,然后用20mL0.03mol·L1.3.3.不同ph值的正丁醇和6%对甲基苯磺酸缩合物的制备采用Doskochilova溶剂系统:(1)用水饱和的正丁醇;(2)用水饱和的正丁醇,内含2%对甲基苯磺酸;(3)正丁醇∶醋酸∶水=2∶1∶1;(4)用水饱和的正丁醇,内含2%六氢吡啶;(5)pH值7.0的0.5mol·L(6)用正丁醇饱和的水,内含2%对甲基苯磺酸;(7)苯∶甲醇=4∶1,滤纸用pH值7.0的0.5mol·L(8)75%甲醇,25%水(内含3%NaCl),滤纸用5%硫酸钠处理。取样品10μL点至距滤纸条(1cm×20cm)下端1cm处,在密闭的层析缸(35cm×15cm×20cm)中上行扩展,溶剂扩展18cm后停止层析。溶剂10mL,滤纸使用前先用展开剂饱和30min。采用生物显影法测试抑菌位置1.3.3.准分子离子检测通过自动进样器吸入10μL样品,然后用C检测方法:用双蒸水溶解精制样品,导入ESI离子源,先用一级全扫描质谱方式获得样品的准分子离子峰[M+H]2结果与讨论2.1选拔结果2.1.1海洋细菌对发酵液中的抗性菌株的筛选通过以水稻黄单胞菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大丽轮枝菌、意大利青霉、稻梨孢菌、灰葡萄孢菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌等7种植物病原菌为指示菌进行初筛,获得发酵液具有抗性的海洋菌株共81株,占筛选的海洋细菌总数的19.7%。对各病原菌的抗性菌株数量进行了统计,结果见表1。由表1可知,411株海洋细菌中对玉蜀黍平脐蠕孢菌具有抗性的菌株较多,筛得率为12.2%;而对意大利青霉具有抗性的菌株较少,筛得率为6.2%;其它菌的抗性菌株筛得率在8.3%~9.9%之间。2.1.2海洋细菌感染情况复筛结果显示,只有7株海洋细菌的无菌发酵上清液还表现出抑菌活性,占筛选总数的1.7%,这说明大部分抗性菌株可能是通过营养竞争、活性物质含量过低、持续性分泌不稳定活性物质等方法来达到抗菌目的;且411株海洋细菌无菌发酵上清液对大丽轮枝菌、意大利青霉、灰葡萄孢菌均无活性。7株海洋细菌中:A018是海洋死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)、A019、A142、A206是海洋枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、A178是海洋Lysinibacillus属细菌(Lysinibacillussp.)、A397是海洋莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)、A493是海洋独岛枝芽胞杆菌(Virgibacillusdokdonensis)。它们的抑菌效果见表2。2.1.3对病原细菌和真菌的抗性抗菌谱测定实验从7株复筛菌中发现了一株抗菌谱特异的菌株A493(MCCC1A00493)。菌株A493无菌发酵上清液的抑菌效果见图1。由图1可知,菌株A493对陆地来源水稻黄单胞菌抑制效果最好,对海洋来源浅黄色假单胞菌和盐单胞菌也具有一定的抗性。测定A493对病原细菌和病原真菌的抗菌谱,见表3。由表3可知,A493产活性抗菌物质对陆地来源水稻黄单胞菌和野油菜黄单胞菌的抗性较强,对海洋来源黄色海假单胞菌、浅黄色假单胞菌和盐单胞菌具有一定的抗性;对胡萝卜软腐欧文氏菌、埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌无抗性。由表3还可知,A493产活性抗菌物质对所测试的真菌均无抗性。表明A493是一种窄谱的拮抗菌,其抗菌谱具有特异性。2.2对水稻白叶枯病害的防治作用菌株A493对水稻白叶枯病害的生防效果见表4。由表4可知,水稻生长20d后A493无菌发酵上清液对水稻白叶枯病害防治效果达到了66.7%;接病原菌对照100%发病;不接病原菌对照生长良好。2.3重要物质amba93的分离、精制和鉴定2.3.1不同浓度紫外分光光度对黄单胞菌抑制活性的影响经过前处理的样品先通过纤维素型阳离子交换填料CM-52提纯,结果见图2。由图2可看出,220nm紫外检测波长下共有5个峰出现,分别收集,真空旋转蒸发浓缩后测试其对水稻黄单胞菌的抑制活性。结果显示只有最早出现的A峰物质具有抑菌效果。2.3.2不同真空旋转蒸发浓缩对黄单胞菌的抑制活性由图3可知,220nm紫外检测波长下共有2个峰出现,分别收集,真空旋转蒸发浓缩后测试其对水稻黄单胞菌的抑制活性。结果显示只有B峰物质具有抑菌效果。2.3.3薄层层析方法将离子交换法分离收集的活性样品旋转蒸发干燥,用一定量甲醇溶液溶解,按1.3.3.4方法进行薄层层析。第一次分离结果显示,有4条主要条带(图4A),测试抑菌活性发现,只有条带d具有活性,R再将有活性的条带d浓缩制样进行第二次分离。结果显示有4条主要条带(图4B),测试抑菌活性发现,只有条带I具有活性,R2.3.4测活性测试分别将各洗脱溶液旋转蒸发后用水溶解,测试活性。结果显示,用30mLpH值7.0的纯水就可以将活性物质完全洗脱,进一步去除了杂质。2.3.5活性物质的初步筛选按照Doskochilova系统方法进行纸层析,通过生物显影法,测定抗菌活性物质在8种溶剂系统中的展开距离,计算R由图5可看出,A493产生的抗菌活性物质与链霉素的纸层析图谱(图5A中圈中部分)最为相似,结合其强极性且可以被水合茚三酮染色显淡黄色的性质,初步推断为氨基糖苷类抗生素。2.3.5电喷雾质量分析图6由图6可看出,在一级全扫描的情况下,获得了样品的[M+H]2.4水稻黄单胞菌的抗菌谱和抗菌材料的制备以多种植物病原菌为指示菌,对411株海洋菌株进行了抗菌筛选。通过对水稻黄单胞菌等植物病原菌进行筛选,初筛获得具有抗性的海洋菌株共81株,占筛选的海洋细菌总数的19.7%;复筛获得具有抗性的海洋菌株只有7株,占筛选总数的1.7%。造成这种结果的原因可能是由于菌株的营养竞争、持续性分泌不稳定抗菌活性物质、活性物质含量过低等因素导致的。通过高通量筛选获得一株分离自东太平洋深海多金属结核区的深海独岛枝芽胞杆菌(V.dokdonensis)A493。无菌发酵上清液抗菌谱测定显示其对陆地来源水稻黄单胞菌、野油菜黄单胞菌以及一些海洋来源黄色海假单胞菌、浅黄色假单胞菌、盐单胞菌具有抗性;对胡萝卜软腐欧文氏菌、埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌和恶臭假单胞菌以及测试的真菌均无抗性。表明其具有特异的抗菌谱。通过阴、阳离子交换色谱法粗提取、2次薄层层析硅胶板回收分离,得到纯化活性物质,经过ESI-MS本研究通过Doskochilova系统纸层析分析,结果显示活性物质为氨基糖苷类物质,一般的氨基糖苷类抗生素,例如庆大霉素、卡那霉素、核糖霉素、新霉素、巴龙霉素