亚胺培南耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究

铜绿假单胞菌属假单胞菌，是医院感染的常见病原体。碳青霉素类抗生素是目前临床治疗铜绿假单胞菌感染最有效的药物之一。近年来,国内外文献报道铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药呈逐渐上升趋势11.1材料表面1.1.1室痰标本系统鉴定20株铜绿假单胞菌临床分离株均由中山医科大学附属三院呼吸细菌室痰标本中分离,并经法国BIOMERIEUX公司API20NE系统鉴定。标准质控株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922为中山大学附属第二医院保存菌株。1.1.2iiid公司的设计药敏纸片:亚胺培南(IMP)、头孢曲松(CRO)、头孢他啶(CAZ)为英国OXIOD公司产品。Muller-Hinton肉汤、Muller-Hinton琼脂均为Difico公司产品;L-肉汤(L-B):氯化钠5g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸膏5g/L,其中胰蛋白胨和酵母浸膏为Difico公司产品,氯化钠为广州化学制剂厂产品。1.1.3ylsarcos系统Tris、2-巯基乙醇、氯唑西林、克拉维酸、头孢噻啶和十二烷基肌氨酸钠(N-LaurylSarcosineNa):Sigma公司产品;丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺:BIO-RAD公司产品;甘氨酸和十二烷基磺酸钠(SDS):日本和光纯药株式会社产品;四甲基乙二胺(TEMED):Serva公司产品;蛋白质分子量标准:上海东风生化试剂厂产品。1.1.4细胞粉碎机和分析方法L8-M低温超速离心机:美国Beckman公司产品;DF-D恒流恒压电泳仪:北京东方仪器厂产品;Mini-PROTEANⅡ垂直板电泳槽:BIO-RAD公司产品;JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机:宁波新芝科器研究所产品;HZS-H水浴恒温振荡器:哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品;751-GW紫外分光光度计:上海分析仪器厂产品;分光光度扫描仪:美国Beckman公司产品;高速冷冻离心机:美国Beckman公司产品。1.2方法1.2.1外药过敏试验及抗药菌群落采用Kirby-Bauer法进行药物MIC测定。培养基为Muller-Hinton肉汤,接种菌量101.2.2超声碎细胞的制备从M-H琼脂平板上挑取单个铜绿假单胞菌菌落到20mlL-肉汤中振荡培养16h至对数生长期。然后转种至300mlL-肉汤中,接种菌量为5%,37℃振荡培养20h。7000r/min4℃离心10min收菌,用10mmol/LpH7.0PBS洗涤2次并悬浮于其中。置冰浴超声碎菌4min,每次10s,间隔5s。5000r/min4℃离心15min,弃未破碎的细胞。取上清液4℃40000r/min离心1h,弃上清,将沉淀颗粒悬浮于10mmol/LpH7.0PBS中(内含2%十二烷基肌氨酸钠),室温作用30min。将此混悬液30000r/min室温离心30min,弃上清,并用1%十二烷基肌氨酸钠洗涤2次。提纯后的外膜蛋白悬浮于10mmol/LPH7.0PBS中。紫外吸收法测定蛋白含量。根据公式:蛋白浓度(mg/ml)=1.451.2.3蛋白质变性分离蛋白样品溶于等体积样品缓冲液中,100℃加热5min使蛋白质变性。经SDS-铜绿假单胞菌GE(分离胶10%)分离外膜蛋白。恒流电泳32mA1h,经固定、考马斯亮兰R-250染色、脱色后观察。1.2.4凝胶分光光度法确定oprd2的位置用标准蛋白质分子量与电泳蛋白带至分离胶距离在半对数坐标纸上作标准直线,根据标准直线测定分子量45KD离分离胶的距离及OprD2能被水杨酸盐抑制的特性,确定OprD2的位置。用分光光度扫描仪测定OprD2的相对含量。1.2.5-内酰胺酶活性测定离心收集对数生长中期菌液,置冰浴超声碎菌,破碎后的菌液4℃离心,21000r/min,1h,上清液为β-内酰胺酶粗提液。Nitrocefin纸片定性检测β-内酰胺酶,纸片由浅黄色变为橙红色为阳性。以0.1mmol/L头孢噻啶为底物,在37℃、pH7.0条件下用紫外分光光度计260nm波长进行时间扫描测定酶活性。一个β-内酰胺酶活性单位定义为每毫克蛋白酶在37℃、pH7.0条件下每分钟水解头孢噻啶的微摩尔数。1.2.6gimp、10gcro胶片的测定以大肠埃希菌ATCC259220.5麦氏单位均匀涂布M-H平板,中心分别贴10μgIMP、10μgCRO纸片,距纸片边缘5mm处向外切出4个相互垂直的宽1mm、长20mm狭缝,每缝中加入待测菌酶粗提液40μl,35℃孵育过夜,观察结果。平皿上出现沿槽周围生长指向纸片的矢状菌苔,表明该酶能水解相应的抗菌药物。1.2.7酶粗提取液4.5%酰氯化反应对阳性株,进一步采用改良三维试验进行酶类型筛选。如果所产酶能水解亚胺培南,则水解底物采用亚胺培南,于槽内分别加入40μl酶粗提液、36μl酶粗提液+4μl克拉维酸2mmol/L、36μl酶粗提液+4μl乙二胺四乙酸(EDTA)200mmol/L、40μl磷酸盐缓冲液100mmol/L;如果不能水解亚胺培南,则水解底物采用头孢曲松,于槽内分别加入40μl酶粗提液、36μl酶粗提液+4μl克拉维酸2mmol/L、36μl酶粗提液+4μl氯唑西林2mmol/L、6μl酶粗提液+4μl克拉维酸2mmol/L+4μl氯唑西林2mmol/L,35℃孵育过夜,观察结果。1.2.8标准品溶液的贴放0.5麦氏单位待测菌菌液均匀涂布M-H琼脂平板,中间贴10μgIMP和30μgCAZ纸片,距纸片1.5～2.5cm处贴一空白纸片,加2～3μl2-巯基乙醇原液。35℃培养过夜,如靠近2-巯基乙醇侧IMP和CAZ抑菌环有扩大者为产金属酶菌株。22.12表1显示了0株铜绿假单胞菌对亚胺培南mic的影响2.2铜绿假单胞菌外膜蛋白谱分析亚胺培南敏感株1、2产生了分子量为45KDa的OprD2,而亚胺培南耐药株OprD2均有不同程度的减少,见图1。2.3铜绿假单胞菌oprd2的相对含量分析耐药组OprD2相对含量(2.550±0.947)%显著低于敏感组(4.252±0.869)%(2.4株铜绿假单胞菌的培养