副溶血性弧菌检验

parahaemolyticus〕是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，常常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全，依据副溶血性弧菌的特性，进展以下检验，以便鉴别诊断。一、检验方法〔一〕操作步骤25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂10mL100mL37℃8~16h分别，37℃18~24h3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h涂片镜检：将三糖铁培育基上反响可疑者即底层变黄〔葡萄糖产酸不产气〕、上层斜面不变〔乳糖、蔗糖不分解〕、有动力、不产生硫化氢，进展革兰氏染色镜检形态。〔0％，3％，7％，10％〕37℃24h10％3％7％盐的胨水中生长良好者，连续进展以下有关试验。生化试验：分别接种以下各类生化培育基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖37℃V-P48h24h3.5％37℃、16~18h0.3mL2~3d，将死亡小鼠进展解剖作分别培育。〔二〕检验程序二、结果分析判定及留意事项〔一〕样品处理检材料冷冻，以免影响检验结果。〔如低温冷冻或枯燥时间过长等缘由〕，使菌体处于受伤状态，故基，否则影响细菌生长。8~16h3.5％盐的三糖铁培育基，此时选择数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严峻，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。〔二〕形态与染色0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培育条件下能生长周鞭毛。〔三〕培育特性2％~3％氯化钠的培育基10％以上时不生殖。在肉汤和胨水等液体培育基中混浊生长，需氧性强，常在液体外表形成菌膜，在液体培育条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。在固体培育基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透亮，外表光滑，潮湿，不产0.7％以上琼脂的培育基上能生长周鞭毛〔侧毛〕20~25℃37℃培育单鞭毛的菌株在固体培育基上呈典型菌落，不表现集中生长。培育基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对集中生长有所影响，菌落形态也简洁受条件的影响有所转变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在SSBCBS〔硫代硫酸盐，柠檬酸盐，胆盐，蔗糖〕和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。一般由腹泻病人初期分别者多为典型菌落，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙，外形不整齐或菌落消灭解离，有的在液体培育时呈沉淀生长现象。pH5~10，pH7.2~8.230~37℃。〔四〕生化特性V-P阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，6-1。6-2。6-1副溶血性弧菌的主要生物化学性状项项 目目耐盐性0％ － 甲基红 ＋7％ ＋ v╟p －10％ － 靛基质 ＋葡萄糖产酸＋赖氨酸＋葡萄糖产气－鸟氨酸＋/－蔗糖－精氨酸－甘露醇＋溶血性＋/－硫化氢－注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性。6-2副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别氧葡赖精鸟靛明甘阿甘鼠β硝萄胶v！乳蔗肌拉半菌名化氨氨氨基露露李酸糖液p 糖糖醇伯乳酶产酸酸酸质化醇糖糖糖糖盐气苷6气苷6810＋－＋－＋＋＋－－－＋－d＋－－＋d－＋＋－＋－＋－＋＋＋＋－＋＋－－＋－－＋＋－＋＋d＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－＋－＋＋－d—－＋－＋－＋＋＋d(d)＋＋－－d－＋＋d＋d－－＋－＋－＋＋＋－(d)－＋－－＋－＋＋－＋d－－＋d－＋－d＋－－＋＋－＋dd＋＋－＋＋d副溶血性弧菌v.parahaemoly-ticus溶藻弧菌v.alginolyicuso1v.choleraeo1非o1v.choleraenono1拟态弧菌v.mimicus河弧菌v.fluialisv.ｖulnificus

＋－＋－＋＋＋－ ＋dd －－＋－＋＋－－

d－－梅氏弧菌v.metschnikouii

—－d ＋－d＋＋ d ＋＋d－d－d－－－ d－－v.hollisaev.damsela

＋－－－－＋－－ －－－－＋＋－－＋－－—－d ＋－－－＋ －－－－－＋－－＋－－

d－－d－－注：＋90％以上为阳性；－90％以上为阴性；〔＋〕缓慢阳性；d11％~89％为阳性；〔d〕11~89％缓慢阳性。〔五〕溶血性试验奈川现象”。37℃、24h血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，假设不消灭透亮溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。〔六〕动物试验16~18h5~10h24h呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等病症。将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进展分别，可检出试验菌2~3d但应留意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区分，需要上述毓的检验后，进展毒力证明，三、培育基成分：蛋白胨氯化钠

20g40g结晶紫溶液蒸馏水

pH9.0

5mL1000mL3％4.5mL，pH，加热煮沸，过滤，再参加结晶紫溶液，混合分装试管，121℃15min。〔二〕氯化钠蔗糖琼脂成分：蛋白胨蔗糖琼脂

10g10g50g10g18g0.2％溴麝香草酚蓝溶液20mL

pH7.8

1000mLpH，参加琼脂，加热溶解，过滤，参加指示剂，15min100mL50℃倾注平板。〔三〕嗜盐菌选择性培育基成分：蛋白胨琼脂结晶紫溶液蒸馏水

pH8.7

20g40g17g5mL1000mLpH，参加琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装100mL。〔四〕3.5％氯化钠三糖铁琼脂成分：蛋白胨乳糖蔗糖琼脂酚红

pH7.4

20g5g10g10g1g35g0.2g0.2g12g0.025g1000mLpH0.2％12.5mL，摇匀，分装试管，121℃15min，放置高层斜面备用。〔五〕氯化钠血琼脂〔我妻氏培育基〕成分：酵母膏

3g10g70g磷酸氢二钠5g琼脂

10g0.001g15g1000mL30min〔不必高压〕，45℃左右时，参加颖人或兔血〔5％~10％〕，混合均匀，倾注平皿。〔六〕嗜盐性试验培育基成分：蛋白胨

pH7.7

2g按不同量参加100mL氯化钠生化试验培育基成分：牛肉膏磷酸氢二钠

5g10g35g2g0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水 1000mLpH7.70.5％葡萄糖参加121℃15min100mL121另将各糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌后，取5mL糖液，参加100mL培育基内，以无菌操作分装小试管。〔八〕葡萄糖食盐胨水〔MR-VP〕成分：多胨 5g葡萄糖 5g磷酸氢二钾5g氯化钠 30g1000mL121℃15min。〔九〕食盐胨水〔靛基质试验用〕成分：蛋白胨

pH7.4

20g30g1000mL制法：按上述安排制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。十〕运动性试验培育基成分：牛肉膏3g10g30g琼脂4g121℃15minpH7.4。其次节副溶血性弧菌参考检验方法一、日本食品微生物检验方法〔一〕分别、菌数测定6-2分别、菌数测定程序〔二〕鉴定将TCBS26-3鉴定程序〔三〕检查用培育基pH7.0，121℃15min压灭菌。TCBS蛋白胨蔗糖柠檬酸钠牛胆酸钠牛胆汁粉氯化钠柠檬酸铁

5g10g20g10g10g3g5g10g1g溴麝香草酚蓝〔2％溶液〕20mL〔1％溶液〕琼脂pH8.6

4mL15g1000mL，混合，使全部溶解，校正pH8.6，加热煮沸，不需高压灭菌，倾15~20mL。不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培育基上生长呈蓝绿色菌落，分解蔗糖的细菌呈黄色菌落。我妻氏琼脂〔改进〕培育基成分：酵母膏

5g10g70g5g结晶紫〔0.1％酒精溶液〕1mL琼脂 15g制法：将全部成分溶于1000mL蒸馏水中，调正pH为7.5，至完全溶解后，加热煮沸数分钟，不需高压灭50℃20100mL，混合均匀后倾注平皿。红血球悬液的制备：将人的脱纤维血液，离心沉淀的血球，用0.85％灭菌生理盐水洗3次，最终沉淀的红1:4亚硫酸铋肉汤成分：蛋白胨10g氯化钠25g0.7g氯化镁5g950mLpH9.1，121℃15min，100mL95％1mL100mL，不需加热。20g100mL0.1g；③将①加②溶解20g1min，1食盐碳水化合物肉汤根底液成分：蛋白胨磷酸二氢钠磷酸氢二钠

2g2.5g5g0.5g1.5g0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL制法：将全部成分溶于10005mL，121℃15min10％0.5mL115℃10min0.66g，3.91g，0.19g，4.96g，将上述1000mLHugh-Leifson成分：蛋白胨氯酸钠

2g30g葡萄糖琼脂

0.3g10g4g0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL

pH7.4

1000mLpH3mL，121℃15min。35~37℃培育，两管同时变黄为葡萄糖发酵，只有不加矿物油的培育管变黄时为葡萄氧化。二、耐热溶血毒检验方法溶血素”，检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒，可参考下述方法：〔一〕Sahuria〔樱井氏〕法沉淀线。〔二〕Elek〔本田改进法〕30g，30g，40g，5g，15g1000mL，pH7.3〕培育37℃过夜，在平板上菌落旁约为5mm处放一小滤纸片〔上吸有抗血清〕，室温放一夜，观看滤纸旁有无沉淀红。〔三〕液体培育检验法〔饭田民〕血。〔四〕反相被动血球凝集法〔太田氏〕〔溶血毒〕，此方法极为敏感，可查出微量耐热性溶血毒。并觉察神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。三、至病性试验方法〔一〕兔肠袢结扎试验24h，5cm24h注入空气杀死，开腹检查，有致病性者注菌肠段可见肿胀积液，消灭坏死现象。有少数为阳性者。〔二〕生兔经口试验1~2mL，10~20h24h象。四、血清学检验进展副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用进展副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培育物，用3％食盐水作成较浓的菌悬液，1h100℃OO副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原〔菌体抗原〕，Ｋ抗原〔荚膜抗原〕及Ｈ抗原〔鞭毛抗原〕，日本泷川11O，60个