通用性配体亲和层析法教学课件

通用性配体亲和层析法第七章亲和层析般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性XNY缺点由于这种差异性较小,因此要得到一种纯度稍高的物质,常常需要繁琐的操作,经历较长的时间,但最终收得率却甚低◆1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法,并成功地制备了固定化酶。Y这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯化的方法,于20世纪70年代就有了惊人的发展,并逐步得到了广泛的应用。这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速和高效(见表7-1)表7-1亲和层析纯化人血清中a-抗胰蛋白酶步骤总活性比活性回收率%纯化倍数硫酸铵分级°DEAE-Sephadex01ConA-Sepharose16,6抑制蛋白酶的四数;抑制蛋白酶的冯数/A-吸收值;含有0.5g蛋白质相当于10ml血清;和收集最高峰的活性部分。第一节基本原理◆M-L-S复合物欲分离的大分子物质S与相对应的专一物质L(配体)以次级键结合(亲和能生成一种可解离的络合物LS,其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合,Y而形成ML复合物。人·亲和吸附剂配体L以共价的方式固化到含有活化基团的基质M上,制成亲和吸附剂ML,或者叫做固相载体亲和层析法根据LS之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法,称为亲和层析法affinitychromatography)o亲和层析的原理(见图7-1)每对反应物之间都有一定的亲和力正如在酶与底物的反应中,特异的底物S)才能和一定的酶(E)结合,产生3复合物(ES)样在亲和层析中是特异的配体j+8才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,图71亲和层析的原理示意图并产生复合物1.酶与底物反应产生酶底复合物;2.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂3.亲和吸附剂与样品中有效成分(S)结合产生偶联复合物和未结合的物质(杂质)4.偶联复合物经解离后,得到纯有效成分(S)层析分离过程:样品过柱时,样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰;然后,恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第二个层析峰(见图7-2B)。0.Imol/L酸盐pH10t29x=A=6FB0.1molL姗酸盐p10图7-2E,coli提取液在Sepharose4B(A)和对氨基苯-P-D-硫代吡喃半乳糖苷-Sepharose.柱(B)的层析l对氨基苯-p-D-硫代吡喃半乳糖苷是阝半乳糖苷酶底物的类似物。柱平衡液为0.05ml/LTes-lCI缓冲液,pH.5;洗脱液为0.1mol/L硼酸钠盐溶液,pH105;抽提液20ml加在1.5cm×22cm柱上,23℃,流速80m/h,每管收集0.8ml;B图中左和右柱状图分别为A图中第40管和B图中第95管收集液的PAC图谱如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,刂采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。使用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用。◆上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法配体,一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力;◆另有一种亲和层析法叫:通用性配体亲和层析法配体,则一般为简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等),它成本低廉,具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎

7、自知之明是最难得的知识。——西班牙

8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加

9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯

10、阅读