遗传学课件第7讲：植物转基因育种

第7讲:植物转基因育种一、植物转基因育种概述（一）植物转基因育种概念

从供体生物中分离目的基因（或含目的基因的DNA片段）,经DNA重组与遗传转化或直接转入受体植物，经过筛选获得稳定遗传与表达的遗传工程体，并经田间选择与试验育成表现出目标性状的植物新品种或种质资源的育种方式。

转基因作物（GMcrops，GeneticallyModifiedcrops）

转基因食品（GMfood，GeneticallyModifiedfood）（二）转基因育种的优势可打破物种界限，拓宽可利用的基因资源；为培育高产、优质、高抗品种提供新的育种途径；可定向改良受体品种的个别目标性状，但不改变其遗传背景和既有性状；大大提高选择效率，加快育种进程;可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。（三）转基因育种的程序基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品系市场开发载体的构建农杆菌介导，基因枪轰击,等筛选遗传稳定性评价表达及表型鉴定转基因品种区域试验、品种审定（四）转基因育种涉及的植物自1983年报道第一例转基因烟草以来，至今已有200多种植物转基因成功。已大面积推广应用的转基因作物主要包括：大豆(≈3/4)、棉花(≈4/5)

油菜(≈1/4)、玉米(≈1/3)（五）转基因育种涉及的主要目标性状抗（耐）除草剂抗虫抗（耐）病：细菌、真菌、病毒、线虫等病害抗（耐）非生物胁迫：干旱、水涝、盐碱、极端气温、瘠薄土壤提高品质：蛋白、脂肪酸、淀粉、油脂、维生素等的组成及含量，耐储藏性、休眠特性、花色，等提高产量：高光效、农艺性状、经济性状雄性不育（六）全球转基因植物育种进展全球转基因作物交易额：2005年达60亿美元；2010年达200亿美元。截止2010年，先后有59个国家通过了964项安全管理认证，涉及的植物种类有24种；29个国家种植商品化转基因植物；1540万农民种植转基因作物。(七)我国转基因植物育种进展1992年中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草，揭开了全球转基因作物商业化的序幕。至2012年，我国已研发获得重要性状基因300多个，其中46个具有自主知识产权。至2012年，我国已发放7种转基因作物的安全证书：耐储藏番茄、抗虫棉、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、抗虫水稻、转植酸酶玉米（降解饲料中的植酸磷、释放可被动物利用的无机磷、提高饲料利用效率，同时减少动物粪便中磷的排放）我国成为世界六大种植转基因作物的国家之一，主要是转基因抗虫棉。

2010年我国转基因棉花种植面积为349万公顷，占总种植面积七成以上。二、植物转化的受体系统及转化方法（一）受体系统：指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养方法，产生高效稳定繁殖的无性系，并能接受外源DNA整合、对抗生素等选择敏感的再生体系。愈伤组织再生系统原生质体再生系统生殖细胞受体系统胚状体再生系统直接分化再生系统叶绿体再生系统

植物基因转化的外植体建立植物转化受体系统的主要考虑因素：具有稳定的外植体来源具有高效稳定的再生能力具有较好的遗传稳定性对选择性抗生素敏感对农杆菌侵染敏感；低成本（二）转化方法1.农杆菌介导法(Agrobacterium-mediatedtransformationmethod)农杆菌介导法程序载体制备感受态制备共培养洗涤农杆菌分化成苗转化子筛选工程菌制备炼苗移栽鉴定2.基因枪法：（genegun，microprojectilebombardment）利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金粉（或钨粉）等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入受体细胞的目的。发生士大夫受体细胞或组织的预处理DNA微弹的处理受体材料的轰击过渡培养和筛选培养渗透压调节甘露醇/山梨醇CaCl2、亚精氨、无水乙醇处理DNA+(金粉或钨粉)3.花粉管通道法：(pollen-tubepathway)

利用植物受精过程中形成的花粉管通道将外源DNA导入植物的技术，为我国学者周光宇创立，1983年成功用此法将外源DNA导入棉花中。基本原理：授粉后外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。操作方法:（1）柱头切除法；（2）花粉粒吸入法；（3）柱头涂抹法4.聚乙二醇法：（polyethyleneglycol,PEG）

利用PEG使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促使相互间接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，然后恢复膜透性，进行培养分化。5.电击法（electroporation）

又称电穿孔法，利用高压电脉冲作用使细胞膜上形成可逆性的瞬间通道，从而使外源DNA分子进入细胞的转化方法。6.显微注射法（Microinjection）

利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞（如原生质体），并使其成活、增殖而发育成为转基因个体。7.浸渍法：将叶片、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方式。基本原理：利用植物细胞自身的物质运转系统，将外源DNA直接导入受体细胞。外源DNA分子进入细胞的途径：①细胞间隙和胞间连丝途径；②细胞的内吞作用；③细胞膜的透性常用植物基因转化方法比较评价项目植物基因转化的方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无转化率较高较低较低较高较高较低嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜转化工效高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛三、外源基因的表达、检测与遗传特性

转基因植物外源基因的表达及其调控外源基因的检测转基因植物的遗传特性（一）转基因植物外源基因的表达及其调控转基因沉默现象：外源目的基因在转化植株内存在，但其表达水平很低，甚至不表达的现象。按其发生的阶段可分为转录沉默和转录后沉默。转基因沉默机理包括DNA甲基化、多拷贝整合、位置效应、后成修饰作用等。提高外源基因表达水平的策略

强启动子的选择和改造；利用增强子序列；利用真核基因的调控序列；利用定位信号提高外源基因表达产物的含量；叶绿体转化（基因拷贝数多）

（二）外源基因的检测

转基因植物应符合的条件及证据：①要有严格的对照（阳性、阴性）；②转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生物学证据，物理数据（PCR，Southern杂交，Northern杂交，Western杂交等）与表型数据（酶活性分析等）；③提供外源基因控制的表型性状证据（抗虫、抗病等）；④根据该植物的繁殖方式（有性或无性）提供遗传证据：有性繁殖植物需要目的基因控制的表型性状传递给后代的证据；无性繁殖植物要有在繁殖后代中稳定遗传的证据。

报告基因的表达检测：

1、Gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因）

2、NPT-Ⅱ基因（新霉素磷酸转移酶基因）

3、GFP/RFP基因（绿色/红色荧光蛋白基因）

4、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱、章鱼碱）

5、cat基因（氯霉素乙酰转移酶基因）

6、pat基因（抗除草剂基因）

7、潮霉素抗性基因外源目的基因的检测外源基因的整合的Sourthern检测外源基因的转录的Northern检测外源基因表达蛋白的酶联免疫吸附法（

ELISA)和WesternBlotting检测外源基因整合和表达的原位杂交检测转基因植物的PCR检测外源基因整合和表达的其他分析方法

RFLP,RAPD,整合位点遗传分析,生物芯片分析（三）转基因植物的遗传特性外源基因的整合特性

整合位点随机性；

整合拷贝数：单拷贝单位点插入，串联拷贝单位点插入，多拷贝多位点插入；

外源基因整合的遗传效应

位置效应：整合位点不同，表达效率也不同；

重组效应：正效应、负效应和无影响的状态；外源基因的遗传特性

T1代为杂合等位基因，T2代开始分离与纯合孟德尔式遗传：单位点插入符合单基因分离规律；多位点插入符合独立分离规律；

非孟德尔式遗传：转基因丢失；转基因沉默；花粉致死；诱发隐性致死突变或转基因纯合致死四、转基因生物安全性评价与管理

转基因生物的安全性问题至今仍在全球范围内存在激烈的争论。反对者认为转基因生物具有极大的潜在危险，可能会对人类健康和生态环境造成威胁。在欧洲，转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品”。（一）国际上几个关于转基因作物及食品安全性的争议事件：Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年５月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。君主斑蝶事件：

1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼虫死亡。但是2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用１０倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。

斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。

加拿大“超级杂草”事件

由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，并怪罪于转基因。

基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。中国抗虫棉破坏环境事件：

2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，６月４日《Chinadaily》上发表了题为“GMCottonDamageEnviroment”的文章。当天,绿色和平组织在其网站上刊登了长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响。６月５日德国《农业报》发表了题为“中国研究Ｂｔ棉破坏环境巨大”。绿色和平组织的“中国项目主管”声称：“棉农将面对不受控制的超级害虫”、“转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。

事实上，抗虫棉在中国实践多年，深受广大棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。

湖北非法销售转基因水稻种子事件

2005年绿色和平组织在湖北发现非法销售和种植的转基因水稻“Bt汕优63”种子，由此生产的大米已进入市场，担心威胁到消费者的健康和生态环境。

事实上，至今没有任何证据或相关报道证明转基因大米有害。争论的背后实质

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现在转基因作物的安全性已经成了国际贸易的技术壁垒。由于某些媒体的炒作，对消费者的心理和转基因作物的产业化已经产生了很大的负面影响。

我们的判断？

（二）转基因植物的安全性评价（风险评估）1.转基因植物食品的安全性评价（1）评价内容

毒性：必须确保转入的外源基因及其产品对人畜无毒。

过敏源：如果有过敏源形成基因转入植物中，可能会对过敏人群造成不利的影响。

抗生素抗性标记基因：目前尚无足够证据表明此类基因安全或不安全，因此提倡无标记（marker-free）转基因产品。（2）评价原则

实质等同原则：转基因食品是否与市场上销售的对于食品具有实质等同性（成分、含量等）

预先防范性原则：转基因植物