分子生物学技术在病理学中的应用-课件

第三章

分子生物学技术在病理学中的应用1ppt课件第一节

原位分子杂交技术

(insituhybridization，ISH)2ppt课件核酸分子杂交概述检测核酸分子间序列同源性的一种技术，主要根据核酸碱基互补的原则（C-G、A-T、A-U）,用已知顺序的核酸片段(DNA或RNA)作为探针，经特殊标记后，与提纯的或组织、细胞中的靶核酸进行杂交，对其进行检测。核酸分子杂交可以在DNA-RNA、RNA-RNA、DNA-DNA之间进行。3ppt课件杂交类型按其作用方式大致分为固相杂交和液相杂交两种。液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液；包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。4ppt课件固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）、斑点杂交法（Dotblot）、Southern印迹杂交（Southernblot）、Northern印迹杂交（Northernblot）和组织原位杂交（Tissueinsituhybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。5ppt课件原位分子杂交技术

（Insituhybridization,ISH)简称原位杂交，指应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组化或免疫组化的方法在被测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电镜下显示出目的DNA或RNA在细胞内定位。6ppt课件可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、细胞印片、涂片上进行杂交，因此能结合病理形态的变化，检出细胞或组织中200-300拷贝以上的核酸序列。属于固相核酸分子杂交的范畴7ppt课件区别：菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交；Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Northern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。8ppt课件基本方法①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色；⑤对照实验和结果的判断9ppt课件组织固定目的：形态结构；保存细胞内的DNA，RNA的水平；探针易于进入DNA稳定，mRNA相对稳定，而RNA则易被酶等降解；石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。

10ppt课件常用固定剂1.4%多聚甲醛磷酸缓冲液最常用，不与蛋白质产生广泛交联，不会影响探针穿透入组织或细胞，较好的保留RNA；2.3:1乙醇冰醋酸增加探针的穿透性，但不能最大限度保存RNA，对组织有损伤；3.戊二醛较好保存RNA和组织形态，但与蛋白质产生广泛交联，影响探针的穿透性；11ppt课件玻片和组织切片的处理

盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。粘附剂涂抹玻片12ppt课件增强组织的通透性和核酸探针的穿透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂TritonX-100或某些消化酶如蛋白酶K、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，在用量及孵育时间上应慎为掌握。13ppt课件减低背景染色

杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。

预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。减低残留的内源性的RNA14ppt课件防止RNA酶的污染手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃，最低温度必须在150℃左右）烘烤以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。

15ppt课件核酸分子杂交探针分子杂交是核酸链间依碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性，利用分子杂交特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链称为核酸探针。16ppt课件核酸探针的类型根据标记方法可分为放射性和非放射性两类。放射性者有污染，显影时间长等；非同位素标记，常用的有生物素、地高辛、5-BrdU(嗅脱氧尿嘧啶核苷)、荧光素等。非同位素标记操作方便，标记好的探针可以长期保存，随时取用，且实验时间短，结果可在光镜下观察。17ppt课件18ppt课件根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针（单链DNA和双链DNA

）、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。cDNA（complementaryDNA）探针：以RNA为模板，经逆转录酶催化按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息的方向相反，故称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。19ppt课件20ppt课件

21ppt课件寡核苷酸探针近年应用较多的寡核苷酸探针，常为20-30个碱基，分子量小，有利于探针进入细胞内，无须采取提高细胞通透性的措施。非克隆性DNA探针，在无cDNA的情况下，可根据已知文献发表的共同序列由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工合成。22ppt课件寡核苷酸探针制造方便，价格低廉，也可进行放射性与非放射性标记特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高

23ppt课件成套ISH试剂盒病毒系列(EBV、HBV、HCV、HPV等)癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、nm23、P16、P21等）细胞因子系列(EGF、bEGF)24ppt课件原位分子杂交实验步骤：（1）切片脱蜡入水（冰冻切片先用多聚甲醛固定）；（2）PBS（0.1M）洗涤，5分钟1次（RNA杂交用DEPC水洗涤）；（3）0.1NHCL，10分钟；（4）PBS洗涤3分钟2次；（5）蛋白酶K消化：（6）---（7）-----25ppt课件杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。26ppt课件显示又称检测系统。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。27ppt课件对照实验和结果的判断常用的对照试验有下列几种。（1）将cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。（2）与非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。（3）将切片应用RNA酶或DNA酶进行须处理后杂交。应用同义RNA探针进行杂交。（4）以不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)。（5）组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。（6）应用未标记探针做杂交进行对照。28ppt课件

荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.29ppt课件FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到DNA切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列，可对DNA定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术。缺点：方法费时、价格昂贵，所需设备复杂并需特殊的照相机记录暂时的信号及不能观察组织形态学等。30ppt课件CISH显色原位杂交法（Chromogenicinsituhybridization，CISH）

2000年Tanner首次报道了采用CISH法检测HER2基因扩增的可行性,研究显示CISH与FISH具有极强的一致性。高度特异性的地高辛标记探针进行原位杂交，传统的过氧化物酶显色反应染片过程，在普通光学显微镜下定量检测基因的扩增，操作简单，价格远较FISH低廉，且信号稳定，组织切片储藏方便，并可做组织学评价。31ppt课件原位杂交的应用简介:特异性高；可以精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性；可完整地保持组织与细胞的形态。由定性进入定量，应用也更加广泛。32ppt课件应用基础研究：如基因组团(Genemapping)，转基因检测，基因表达定位，核DNA和mRNA的排列和运输、复制和细胞的分类等；临床研究：如细胞遗传学，产前诊断，肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。33ppt课件(1)在肿瘤研究中的应用:（A）.检测肿瘤组织中癌基因，抗癌基因的表达,以判断预后。如发现原癌基因C-myc在Burkitt淋巴瘤,大肠癌，小细胞肺癌中有扩增；CerbB-2的扩增与乳癌淋巴结转移呈正相关。34ppt课件（B）检测肿瘤标志物mRNA,对肿瘤的早期诊断及治疗有重要的意义。如检测人肝脏和癌旁肝细胞中AFPmRNA，在肝癌细胞及癌旁组织均发现了AFPmRNA,但癌组织中AFPmRNA阳性较均一,而癌旁肝中AFPmRNA阳性呈散在分布.35ppt课件36ppt课件(2)组织、细胞中病毒DNA或RNA的检测在淋巴瘤细胞及鼻咽癌细胞中发现EBV，在肝炎、肝癌细胞找到HBVDNA，尤其是在原发性肝癌中其整合率可达90%;粥样硬化的主动脉内发现了单纯疱疹病毒；检测细菌，疟原虫等的核酸序列。37ppt课件38ppt课件39ppt课件40ppt课件

(3)细胞的生物合成

及遗传疾病研究中的应用组织，细胞内mRNA可以反映组织合成某种蛋白质或多肽的能力，其敏感性要比直接测定蛋白质高1000倍，以cDNA作为探针的ISH结合免疫组化技术，可以了解单个细胞内mRNA的翻译水平，即蛋白质合成能力，从而了解组织器官的代谢和功能状态，以及器官组织内不同细胞的功能差异，并能同时进行形态学观察。41ppt课件42ppt课件

第二节

聚合酶链反应

(polymerasechainreaction

，PCR)

43ppt课件聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。44ppt课件Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。1993年Mullis获得了诺贝尔化学奖.Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段;1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR;1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus

aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。

PCR技术简史45ppt课件PCR原理

PCR实际上是以DNA为模板，在引物和4种核苷酸存在的条件下，在DNA聚合酶作用下出现的酶促合成反应。PCR最重要的组分是引物，是根据模板DNA的序列设计合成的两条20个核苷酸左右的寡核苷酸链，这两个引物分别特异性结合在模板DNA二条链的两侧（3’—端）。46ppt课件反应体系：DNA模板，一种引物，四种三磷酸核苷，TaqDNA聚合酶及含MgCL2的缓冲液。47ppt课件循环（1）变性(denaturation)：在95℃左右，常规采用94℃，30秒-1分钟，在高温条件下使模板DNA解链为单链模板；（2）退火(annealing)：在较低温度下，引物特异地结合到DNA模板上，温度在55℃左右，时间30秒-1分钟；（3）延伸(extension)：在72℃条件下，DNA聚合酶根据模板的序列，在引物的3’端新合成的互补链不断延伸。根据模板的长度，延伸时间一般1-2分钟。48ppt课件49ppt课件50ppt课件51ppt课件PCR的反应动力学PCR反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。52ppt课件PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的53ppt课件分析与鉴定PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。常用方法如凝胶电泳分析、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶切分析、分子杂交（Southern印迹杂交、斑点杂交）、核酸序列分析等。54ppt课件PCR反应体系与反应条件（一）、标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10-100pmol

模板DNA

0.1-2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul55ppt课件PCR反应五要素：引物:PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。酶及浓度:浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP:dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，模板:模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一.Mg2+:Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响56ppt课件PCR常见类型1．逆转录PCR(RT-PCR)：RNA经逆转录后可作为PCR的模板.,用来扩增RNA。2．竞争逆转录PCR(C-RT-PCR)：低丰度RNA定量的好方法。3．多重PCR（multiplesPCR）：在同一PCR体系中加入多对引物可用于基本长度很长，发生多处缺失的检测。扩增同一模板的几个区域。4．多种PCR：可同时加入多套以生物素标记的引物PCR反应。57ppt课件5反向PCR（iversepolymerasechainreaction）：对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。6不对称PCR:在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

7锚定PCR（anchoredpolymerasechainreaction）8着色互补试验或荧光PCR9双温PCR（two-temperaturePCR）58ppt课件PCR技术的应用研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌等)；病毒(HTLV、HIV、HBV、HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19)；寄生虫(疟疾等)；人遗传病(地贫、血友病等)免疫学：HLA分裂；T细胞受体或抗体多样化的定性；自身免疫病基因作图；淋巴因子定量59ppt课件人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析；HLA-DQ肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；生态学；环境科学；实验遗传学。古生物学：考古与博物馆标本分析动物学：动物传染病的诊断等植物学：检测植物病原等PCR技术的应用60ppt课件病理学中应用的PCR种类：（1）普通PCR：对病理档案资料进行回顾性研究。因普通PCR是将核酸提取后再进行扩增，无法明确样本DNA的定位。61ppt课件（2）原位PCRHasse等于1990年建立的技术原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，在扩增剂中掺入示踪剂，或扩增后再作原位杂交，用该法检测细胞内单拷贝基因片段比单用原位杂交的敏感性有极大的提高。不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。

62ppt课件原位PCR检测宫颈组织中HPV16-DNA（阳性细胞核为黑色）免疫组化检测细胞角蛋白（棕黄色）

63ppt课件64ppt课件（3）逆转录PCR

（retrotranscriptionPCR,RT-PCR）以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，以cDNA链为模板进行的PCR反应。常用新鲜组织或细胞提取的RNA经逆转录酶作用后合成互补DNA（cDNA），再以此cDNA为模板进行扩增，以检测组织，细胞内特定基因的表达或检测病人标本中的RNA病毒。65ppt课件66ppt课件（1）检测外源性基因片段，病毒性，寄生虫性及细菌性疾病的诊断，提高检出率，集中在病毒感染的检查上；在特殊染色，免疫组化或原位杂交阴性的组织中PCR检测可获阳性结果，如结核杆菌，如HIV、HPV、HBV、CMV，

EB病毒，疟原虫，弓形虫等。PCR在病理学中的应用67ppt课件病原微生物的检测可根据病原体的基因序列，选择特异的顺序作为PCR引物，后检测是否有PCR产物而测知病原体的存在。观察病原体在体内分布规律。68ppt课件（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。69ppt课件A）癌基因的研究：如用PCR方法发现在胰腺癌，结肠癌，甲状腺癌等标本中有ras基因的突变，且ras基因的突变与肿瘤发生的早期阶段有关。在结肠，直肠息肉和癌旁组织中发现C-myc-mRNA的表达水平明显增高，其表达水平与肿瘤组织学分型和体积大小明显有关，和结肠，直肠息肉的恶性潜力有关。肿瘤的诊断和研究70ppt课件B）抗癌基因的研究肺癌，结肠癌和乳腺癌等P53抗癌基因点突变而灭活视网膜母细胞瘤的发生关键是患者抗癌基因Rb的缺失或点突变，使细胞不能产生具有正常功能的蛋白，或形成无功能蛋白产物。71ppt课件C）肿瘤相关病毒基因的检测可检测宫颈癌，肝癌，鼻咽癌等与病毒密切相关的肿瘤中病毒在细胞基因中整合状态和其位点，研究病毒和肿瘤的关系，为肿瘤的防止提供理论依据；72ppt课件D）其他肿瘤的早期诊断和筛检原位杂交技术在肝癌细胞和癌旁细胞中均发现了AFPmRNA，在癌组织中AFPmRNA阳性细胞分布均一，而在癌旁组织则中则呈散在分布。另外发现HBVDNA与AFPmRNA可同时出现于肝硬变组织肝细胞内，提示HBV感染与AFP基因活跃表达有关，亦为研究HBV、AFP、肝硬变与肝癌的关系提供了科学依据。

73ppt课件（2）肿瘤疗效监测肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrugresistance,MDR）,MDR细胞中有种特异mRNA，转录这种mRNA的基因为MDR基因，细胞中MDR的mRNA含量越多，细胞的耐药性就越强。MDR的mRNA含量低的白血病患者容达到缓解，并且可以较长时间维持完全缓解，若化疗过程中MDRmRNA逐渐升高，化疗反应会逐渐不敏感。

74ppt课件（3）检测导入基因在转基因动物、器官移植、基因治疗等过程中，原位PCR技术可用于研究外源基因导入机体后与受体细胞之间的相互作用关系。YoshiokaT等将绿色荧光蛋白基因插入干细胞基因组，随后采用原位PCR技术与荧光显微镜分析干细胞移植后在受体中的生长发育情况。75ppt课件（4）遗传病基因检测镰刀状红细胞贫血是珠蛋白基因的点突变所致，可将PCR产物与特异性探针进行斑点杂交而加以证实，对少量羊水细胞或绒毛进行检测，即可达到产前诊断的目的

β－地中海贫血76ppt课件生物芯片

苏州大学医学部

邓敏77ppt课件一、何为生物芯片?一般说来，生物芯片就是在一块厘米见方的玻璃片、硅片、塑料膜等材料上，通过特殊的表面化学处理连接上相关的生物分子，经过特殊设计的生物化学反应，然后由专用的仪器收集检测信号，再用计算机分析数据结果。生物芯片是微电子学、化学、物理学、信息学和生物学相互交叉形成的一项高新技术。78ppt课件

高通量、微型化和自动化芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。主要特点79ppt课件鱼杆钓鱼：以前的基因检测技术均只有一个“鱼钩”，一次只能钓到一条鱼（即找到一种基因）。而基因芯片突出的优点是能在庞大的基因库中，一次发现众多的异常基因，就好比在一根鱼杆上垂有成千上万个钓钩，可同时捕捉许多不同的鱼，从而实现快速多样化检测。80ppt课件基因芯片：计算机芯片是Intel还AMD？其实无论是Intel还是AMD，其本质都一样，都属于半导体芯片。相似：半导体芯片和生物芯片都使用了微加工、光学、光刻等类似技术，都把庞大的系统进行了缩微，最后输出的信号都是数字信号。具有超微化、高度集成、信息贮存量大等特点.生物芯片与计算机芯片的相同81ppt课件第一，输入的信号不一样。半导体芯片很怕水，接触到水溶液就会短路，而生物芯片恰恰要分析液体，输入其中的可能是血液、尿液、唾液等体液，不会出现短路现象；第二，半导体芯片是永久性固定使用，而生物芯片是一次性使用，并伴随着相应的生物化学反应；第三，从材料上来说，半导体芯片以硅为基本材料，而制备生物芯片使用的材料则比较广泛，除了硅，还可以使用玻璃、塑料等其他材料。生物芯片与计算机芯片的不同82ppt课件虽然仅有十几年的发展历史，但在诸如生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域已显示出巨大力的潜力和诱人的前景,带来巨大的革新甚至革命。83ppt课件什么是生物芯片(Biochips)？

生物芯片是将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特异性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分析各种生物分子存在的量的一种技术。

84ppt课件芯片是大约半英寸(1.28cm）的玻璃片或硅片小片，在片上排列着约64000小方格，小格边长约为头发丝的一半。在此片上将大量已知的探针，按顺序列阵固定于片基上，从而获得一高密度（通常探针的密度在65000～600000/cm2）的探针阵列。可制备出包含100万个DNA探针的人类基因检测芯片。这些DNA分子的粘贴位置和其中的基因状态等信息都被存贮在计算机里。85ppt课件研究肿瘤细胞的状况，可以先把人的所有基因都粘在一块玻璃片上，制成基因芯片，然后把肿瘤细胞和正常细胞中的DNA分别放到芯片上进行杂交反应，通过计算机识别，就可以找出肿瘤细胞的基因与正常细胞有何差异，发现导致肿瘤发生发展的因素。人类大约有10万个基因，共计30亿个碱基对。86ppt课件最初的生物芯片主要目标是用于DNA序列的测定，基因表达谱鉴定和基因突变体的检测和分析，所以它又被称为DNA芯片或基因芯片。目前已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，所以改称生物芯片更能符合发展的趋势。87ppt课件主要特点：高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。88ppt课件五、生物芯片的类型：DNA芯片蛋白质芯片组织芯片微缩芯片实验室(Lab-on-chip)

89ppt课件按功能分类测序芯片表达芯片比较基因组杂交(CGH)芯片90ppt课件（一）基因芯片

（genechip）91ppt课件基本概念又称DNA芯片、DNA微阵列(DNAmicroarray)是指采用原位合成或显微印刷技术，将数以万计的DNA探针分子固定于支持物的表面上，产生的二维DNA探针阵列。基因芯片与标记的样品进行杂交后，可通过监测杂交的信号来实现对生物样品快速，高效地监测或诊断。92ppt课件寡核苷酸阵列（芯片）DNA阵列cDNA芯片RNA芯片按探针分类93ppt课件基因芯片结构示意图

94ppt课件基因芯片结合示意图

95ppt课件DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子打印原位合成芯片探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA微集阵列样品核酸的提取与纯化扩增与标记标记样品的纯化杂交及杂交后清洗

扫描与分析96ppt课件芯片的制备（一）支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸97ppt课件（二）制备方法基本类型：一、原位合成（insitusynthesis）采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短二、合成点样：DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活98ppt课件1原位合成制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法。将半导体工业中光刻技术与DNA的化学合成方法结合起来，将光不稳定保护基团的四种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，以少量的保护寡合苷酸和试剂按照设计的序列合成DNA。利用该方法合成芯片的密度和精度比较高，能在1cm2面积合成250000组寡核苷酸探针分子，但需要花费大量的时间进行设计和制造价格昂贵的照相光刻蔽光膜。99ppt课件制备过程首先，将支持物表面羟基化或氨基化（视所要固定的分子为寡核苷酸或核酸而定），在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基，可用光照去除，用特制的光刻蔽光膜（mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位。100ppt课件当光线（如紫外线）通过照相平板印刷的“蔽光膜”到达固相合成特定区域时，则激活这些区域的酶底物，而使光敏保护基团去除，表面的羟基被活化，继而脱氧核酸通过化学连接键添加于去保护位点上；利用化学法加上第一个核苷酸，所加上的核苷酸种类和在芯片上的位置事先确定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。101ppt课件使用多种光刻蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中每次在成千上万个位点上添加一个特定的碱基，探针数目呈指数增长。每个探针都由A、T、C、G的不同组合，换上不同的光刻蔽光膜，光线透射到片上的不同区时，加上不同的核苷酸，如加A核苷时用A膜、加C核苷时换C膜，如此重复这一过程；由4个核苷组成的任一套探针，因此，n个核苷酸长的芯片需要4n循环来合成。102ppt课件例如：合成48（65536）个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需4×8=32步，8个小时完成。合成探针与既定的参考序列互被对应。研究者可按参数设计高密度互补的DNA阵列。103ppt课件

原位合成

(InSituSynthesis)104ppt课件预合成后点样

(off-chipsynthesis)接触式点样：指打印针从多孔板取出样品后直接打印在芯片上。打印时针头与芯片接触。优点是探针密度高，通常一平方厘米可打印2500个探针。缺点是定量准确性及重现性不太好。非接触式点样：针头与芯片保持一定距离。优点是定量准确重现性好，缺点是喷印的斑点大，密度低。通常一平方厘米只有400点。但是日本佳能公司能把喷印点直径大小由150-100μm降到30-25μm。105ppt课件合成后点样板-CartesianTech.106ppt课件

待测样品的制备1、核酸样品的分离纯化2、靶DNA的扩增（PCR）3、样品核酸的标记常用标记：荧光标记物、生物素、放射性同位素。4、标记后样品的纯化107ppt课件二、分子杂交反应

杂交信号的强弱与样品中靶基因的量呈正比。

杂交的条件：盐的浓度、杂交的温度杂交时间、探针的G+C含量探针所带电荷、靶序列的二级结构108ppt课件

三、检测分析方法

CCD（charge-coupleddevices,

电荷偶合装置）检测的摄像系统；激光共聚焦扫描仪。109ppt课件数据处理对扫描数据的采集、处理、分析和报告是生物芯片技术中的一个重要环节，由计算机完成。分析软件：如果只是进行简单的检测或科学实验，待测样品所要分析的基因很少很简单，采用直观的观察就可以得出结论，但对于大量的基因分析或是临床检验人员使用就需要有全面智能化的分析软件辅助。用软件对芯片上的每个点计算平均密度值，从而完成定量，通过对芯片上实验点和对照点的比较，光密度值再进一步转换成生物相关的数据输出。110ppt课件111ppt课件基因芯片的应用1.基础医学中的应用：（1）、基因差异表达分析、（2）、发现新基因（3）、DNA测序（4）、基因突变检测（5）、特异性相关基因的克隆（6）、基因功能研究112ppt课件基因差异表达比较不同的两个细胞系或不同组织来源的细胞中基因表达差异：从不同的两个细胞系或不同的组织来源的细胞中提取mRNA，反转录成为cDNA探针，并在此过程中分别以Cy3-dUTP或Cy5-UTP等两种不同的荧光物质标记，与基因芯片上的cDNA微阵列进行分子杂交。113ppt课件经严格洗脱后以两种不同波长的激光扫描芯片，各杂交点在此两种不同波长的激光下所发射的Cy3和Cy5荧光信号的强度值，即可反映不同样本中各靶基因的转录水平。将Cy3和Cy5两张荧光扫描图叠加，计算两种荧光信号强度的比值(Cy5／Cy3)，经计算机软件处理，即可筛选出Cy5与Cy3标记样本之间表现出差异表达的基因，从而可能发现基因组在不同情况下的表达模式。114ppt课件基因表达mRNA的水平反映了在不同的环境、细胞类型、细胞生长阶段和细胞状态下的功能信息，分析差异表达的基因对于研究基因的功能十分重要。基因芯片具有高度的敏感性和特异性，可以快速检测出1:30000000水平出现的mRNA，监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况，挖掘与疾病诊断、预后和治疗相关的基因，研究基因的功能，确定基因与基因间的相互关系。115ppt课件DNA测序芯片基于杂交测序发展起来的。原理：任何线状的单链DNA或RNA序列均可分解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列(subsequence)，假如把原序列所有这些错落重叠的亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原序列。人类第一个基因组全序列的完成得益于DNA芯片技术的应用。116ppt课件举例例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列：

(1)

CTCATATG

(2)

GCTCATAT

(3)

AGCTCATA

(4)

TAGCTCAT

(5)

TTAGCTCA117ppt课件5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有48(65536)种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。118ppt课件可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推算出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型数据进行分析，重构靶DNA的互补寡核苷酸序列。119ppt课件DNA测序TCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGCGGATCGAGGATCGACGATCGACTATCGACTTTCGGATCGACTTAGCCTAGCTGAA65536个八核苷酸阵列120ppt课件121ppt课件寻找新基因应用于炎症性疾病类风湿性关节炎(RA)和炎症性疾病(IBD)的基因表达研究中，发现除了炎症性疾病诱导的基因如TNF-α、IL或粒细胞集落刺激因子外，还检测出了一些以前末发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。122ppt课件基因突变检测检测突变的原理是以DNA杂交为基础，固定于芯片上的寡核苷酸的序列是根据所需检测的基因分子的序列设计。有点突变的DNA不能与固定于芯片上的基因完全匹配而通过杂交结果的荧光检测而显示出来．

Affymetrix公司已经开发了P53突变检测芯片、HIV突变检测芯片和用于BRCAl群体筛查等多种寡核苷酸芯片，并已被广泛应用．123ppt课件（一）基因诊断1.遗传疾病的基因定位2.感染性疾病的诊断（二）肿瘤研究中的应用1.寻找肿瘤相关抗原；2.肿瘸基因表达谱研究3.肿瘤相关基因功能研究；4.肿瘤分子病理分型；5.肿瘤芯片诊断（三）临床药物研究领域中的应用（药物作用机制、耐药菌株和药敏检测、新药开发等）2、临床医学中的应用124ppt课件（一）基因诊断1.遗传疾病的相关基因定位：可以同时平行获取大量遗传信息，故在遗传病的诊断中有独特的作用。目前已有如地中海贫血、先天性胰岛素分泌过多症等的诊断芯片。125ppt课件2.感染性疾病的诊断：病原微生物的基因组是外源性的，相对遗传性疾病易于检测，芯片的制备要求标准也高．SASA病毒最早的确诊依靠基因芯片。在丙型肝炎检测方面，研究人员利用丙肝病毒基因型检测探针检测丙肝病毒基因，并用专用软件进行图像分析，结果显示基因芯片在丙肝病毒检测中具有高敏感性和高分辨率。126ppt课件（二）肿瘤研究中的应用1.寻找肿瘤相关抗原：机体在发生肿瘤时，有些原来不表达或表达较少的抗原表达相对增多，这些抗原称为肿瘤相关抗原如AFP、CEA等．可以通过基因芯片技术寻找这些抗原；2.肿瘸基因表达谱研究：肿瘤发生是在外界因素的作用下，基因水平发生改变后出现的一系列症状，所以通过基因芯片就能研究其表达谱；127ppt课件3.肿瘤相关基因功能研究：研究了肿瘤基因表达谱后，可以进一步研究各个基因的功能；4.肿瘤分子病理分型：肿瘤表达的分子图谱以进行疾病分子分型，为临床实施个体化治疗奠定基础．5.肿瘤芯片诊断：由于有些肿瘤已经研究的比较透彻，它的有关抗原、基因图谱、病理分型等都很清楚，可以把这些都放在一张芯片上，用来诊断肿瘤。128ppt课件与传统检测方法相比，在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，能及早诊断，待测样品用量小；特异性检测病原微生物的亚型及变异；帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为‘第二阶段医学’）”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）”上了解疾病的发生、发展过程，使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。129ppt课件（三）临床药物研究领域中的应用（药物作用机制、耐药菌株和药敏检测、新药开发等）基因芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步超高通量的筛选等方面具有其他方法不可比拟的应用性和优越性130ppt课件3.其他方面环境监测化学毒物筛选毒理学研究农作物优育和优选食品卫生监督司法鉴定131p