免疫学检验技术-器官移植及免疫学检验

教学目标1.掌握：

移植抗原的种类、HLA分型的方法（重难点）；预防移植排斥反应的免疫学检测（重难点）。2.熟悉：器官移植的概念和种类、移植排斥反应的分类（难点）；移植后的免疫学检测。3.了解：移植排斥反应的发生机制。知识目标技能目标思政-素质目标学会常用的HLA分型及交叉配型的方法。责任心、质控及生物安全意识、临床思维一器官移植概述二HLA分型技术三预防移植排斥反应的免疫学措施四移植后的免疫监测五器官移植面临的主要问题和解决方案设想

指应用异体或自体正常器官、组织、细胞置换病变或功能缺损的器官、组织、细胞，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。移植物供体受体一、移植的概念自体移植（autograft）同系移植/同基因移植（syngraft）同种（异体/异基因）移植（allograft）异种移植（xenogeneicgraft）二、移植的类型是指移植后，受者免疫系统识别移植物抗原或移植物中免疫细胞识别受者抗原，产生免疫应答，导致移植物功能丧失或受者机体损害的过程。三、移植排斥反应

主要组织相容性抗原（MHA）

次要组织相容性抗原（mHA）

ABO血型抗原系统组织特异性抗原（一）诱导移植排斥反应的抗原1、主要组织相容性抗原（MHA）

HLA-DRHLA-A、HLA-B、HLA-DQ和HLA-DP，HLA-C在进行个体移植是，引起移植排斥反应最强的是HLA。在三类HLA中，I、II类分子是引发移植排斥反应的首要抗原，尤其是HLA－DR位点的抗原分子。常染色体编码的mHA排斥反应的程度轻，速度慢性染色体编码的mHA2、次要组织相容性抗原（mHA）3、人类红细胞血型抗原

（1）ABO血型系统(供受者必须一致）（2）Rh血型系统4、组织特异性抗原血管内皮细胞特异性抗原、肾特异性抗原、肝脏特异性抗原、骨髓特异性抗原等。

（二）T细胞识别同种异型抗原的机制1．细胞免疫应答效应2.体液免疫应答效应3．非特异性免疫应答效应

（三）移植排斥反应的效应机制

供体移植物的抗原可被受体免疫系统识别，介导宿主抗移植物反应（hostversusgraftrejection,HVGR），另一方面受者组织抗原也可刺激移植物中的免疫细胞，诱导免疫应答，引起移植物抗宿主反应（graftversushostrejection,GVHR)。

（四）移植排斥反应的类型根据排斥反应发生的时间强度、发病机理、临床表现及病理变化，分为：（1）超急性排斥反应

（2）急性排斥反应

（3）慢性排斥反应

1、宿主抗移植物反应（HVGR）（1）超急性排斥反应（hyperacuterejection）

是指血管接通后数分钟至术后1~2天内发生的不可逆转的体液排斥反应，常见于反复输血、多次妊娠或再次移植的个体，其发生机制与供受者间血型不合、受者血液中预存有抗供者的抗体（包括ABO和Rh抗体，HLA抗体等）有关。

为同种异体移植中最常见的排斥反应类型，一般在术后几天至2周左右出现，约80%~90%在术后1个月内出现。其发生机制主要为细胞免疫，通常急性排斥反应发生越早越严重，后期发生的排斥反应有体液免疫的参与，多数进展缓慢，症状较轻。（2）急性排斥反应（acuterejection）（3）慢性排斥反应（chronicrejection）

指发生于术后数月至数年的缓慢、进行性、不可逆，并最终导致移植物功能丧失的排斥反应，其特点主要是正常组织结构的丧失和纤维化，血管平滑肌细胞增生，移植物血管的破坏。慢性排斥反应的机制尚未完全清楚，目前认为由免疫和非免疫两种机制引起。

当移植物存活后，移植物中的免疫活性细胞（主要是T细胞）识别宿主抗原，诱导免疫应答，攻击受者靶组织的一种排斥反应，常在骨髓（造血干细胞）移植或其他免疫细胞移植（如脾脏、胸腺移植）中发生。

移植物抗宿主病（GVHD）2、移植物抗宿主反应(GVHR）

GVHR的发生条件①移植物中有大量免疫活性细胞②宿主和移植物组织相容性抗原不符③宿主处于免疫功能极度低下状态，没有能力对移植物发动HVGR血清学分型细胞学分型基因分型

第二节HLA分型技术SD抗原

HLA-ABCHLA-DRDQ补体依赖的细胞毒(CDC)试验一、HLA血清学分型技术

将待检淋巴细胞与一系列已知抗HLA标准分型血清混合后，抗体会特异性结合表达相应HLA抗原的淋巴细胞，在补体的作用下，引起细胞死亡，死亡的细胞可被台盼蓝等染料染色，而活细胞由于细胞膜完整不着色，根据死亡细胞的百分比，判定其HLA的型别。1.CDC试验原理2.流式细胞仪分析技术LD抗原

HLA-D和DP

混合淋巴细胞培养(MLC)二、HLA细胞学分型技术

两个基因型不同个体的淋巴细胞，在体外进行混合培养时，由于彼此的HLA不同，能相互刺激导致双方淋巴细胞活化增殖和分化，进而表现形态学的变化和细胞的增殖，可通过形态学或3H-TdR渗入试验来检测淋巴细胞反应的强度，从而判定其HLA型别。

单向MLC和双向MLCMLC原理1.RFLP:限制性片段长度多态性分析2.PCR-SSOP：序列特异性寡核苷酸探针-PCR3.PCR-SSP：序列特异性引物-PCR4.PCR-SSCP：单链构象特异性-PCR5.SBT分型法：基于序列的HLA分型法6.多荧光微珠免疫分析7.基因芯片三、HLA基因分型技术

不同个体间的HLA复合体存在核苷酸碱基序列的差异，这种差异造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，用一组限制性内切酶消化、识别、切割这些位点，产生数量和长度不一的DNA酶解片段，经琼脂糖电泳或用特异性探针与酶解片段进行杂交即可确定HLA的基因型别。也可先对DNA片段进行体外PCR扩增，然后再进行RFLP分析，即PCR-RFLP。1.PCR-RFLP

先对HLA基因片段进行PCR扩增，然后将扩增片段转移至NC膜或尼龙膜上，然后与用放射性核素或酶、地高辛等标记的寡核苷酸探针进行杂交，若待检DNA与探针序列互补，则两者结合，从而确定HLA的基因型别。2.PCR-SSOP

根据各型别HLA核苷酸碱基序列差异，设计出一套HLA等位基因的序列特异性引物，对待测DNA进行PCR扩增，因TaqDNA聚合酶没有3′→5′核酸内切酶活性，引物3′端最后一个碱基是否与模板配对决定着能否扩增出产物。若将引物的3′端最后一个碱基设计在正好有差异的那个碱基序列上，则扩增产物仅需常规琼脂糖电泳，根据特异产物存在与否即可直接对HLA进行分型。3.PCR-SSP

用PCR扩增特定的靶序列,经变性使之成为两条单链,然后在无变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。单链DNA如果存在碱基差异,即使一个碱基的不同,也会表现出电泳迁移率的不同,据此可将不同型别的HLA区分开,达到分型的目的。4.PCR-SSCP

首先用PCR扩增HLA的DNA片段，扩增产物进行纯化和测序，将此序列与HLA基因库的DNA已知序列进行比较，即可获得HLA的基因型别。最可靠也最彻底的基因分型方法。5.SBT分型法

用标记有生物素的特异性引物分别扩增HLA-A、B、DR等基因座位的特异性片段，扩增产物与已知的寡核苷酸探针（事先包被在不同颜色的磁珠上）进行杂交，洗脱没有结合的DNA片段，再与荧光素标记的亲和素结合，多荧光微珠在流式细胞仪上进行结果判读，若扩增的DNA片段能与探针结合则发荧光，不结合则无荧光。6.多荧光微珠免疫分析

首先用PCR扩增获得HLA的DNA片段，用放射性核素或荧光素标记扩增的DNA分子，再与预先点在固相支持物表面的成千上万个代表不同基因的寡核苷酸探针进行杂交，通过放射自显影或荧光检测，杂交结果通过计算机软件处理分析后获得杂交信号的强度及分布模式图，从而反映样品中HLA的基因型别。7.基因芯片移植前组织配型免疫抑制措施第三节预防移植排斥反应的免疫学措施供受者HLA是否相符是移植物存活的主要条件之一，两者的匹配程度决定了移植排斥反应的强弱。HLA系统含有多种Ⅰ类和Ⅱ类抗原基因，但多数情况下只检测HLA-DR、A和B。不同器官的移植对HLA配型要求不同。一、组织配型（一）HLA配型ABO血型必须相同或相容！（二）红细胞血型抗原的配型（三）交叉配型

必须做HLA交叉配型！！方法：1.补体依赖的细胞毒试验（CDC)2.双向MLC3.流式细胞术试验时每一标本至少做3份，同时设阳性对照和阴性对照。

术后使用免疫抑制剂人工调节机体的免疫状态是目前控制排斥反应发生最主要的方式。临床上常用的免疫抑制剂有三类：二、免疫抑制措施1、化学性的免疫抑制剂

常见有：环孢素A、糖皮质激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、他克莫司麦考酚吗乙酯，西罗莫司等。2、生物免疫抑制剂

常见有：抗淋巴细胞球蛋白、抗细胞因子或细胞因子受体抗体、融合蛋白、反义寡核苷酸等。3、某些中草药如雷公藤等。意义早期诊断排斥反应和监测排斥危象的发生，以便及时采取措施。项目体液免疫水平的检测（抗体、补体）细胞免疫水平的检测

免疫分子的监测第四节移植后的免疫监测T细胞亚群及功能检测

单克隆抗体免疫荧光法和流式细胞仪测定T细胞亚群，T细胞转化试验测定T细胞功能，4hT细胞转化试验检测受者致敏T细胞。

NK细胞活性检测

形态学法、荧光标记剩余法一、细胞免疫水平的监测血清抗体的检测包括抗供者HLA抗体、抗供者组织细胞抗体、抗血管内皮细胞抗体、B细胞细胞毒抗体、冷凝集素等的检测。方法：CDC、交叉配型等。血清补体的检测

CH50试验检测活性，免疫扩散和免疫比浊试验检测含量。二、体液免疫水平的监测细胞因子及其受体的检测黏附分子的检测其他分子的检测

C反应蛋白（CRP）、β2-微球蛋白（β2m）三、免疫分子的监测主要问题

1.移植排斥反应

2.供体不足第五节器官移植面临的主要问题和解决方案设想

方案1.诱导同种异型反应性T细胞耐受2.阻断T细胞活化的协同刺激信号诱导T细胞无能3.调控Th细胞向Th