神经元的电活动课件

神经元的电活动主讲人：高隽

南京医科大学神经生物学系2、膜片钳技术及其应用3、膜片钳系统装置1、细胞电生理学意大利解剖学和医学教授伽伐尼（LuigiGalvani,1737～1789）生物电的发现用两种不同的金属碰触青蛙腿的两端，可以引起它的收缩。神经系统信号的传递都通过电或者化学信号，其中电信号对于信息的快速及长距离传播具有重要意义。所有的电信号（受体电位、突触电位、动作电位）都是通过膜两侧的离子浓度变化来实现的，离子进入或者流出细胞导致细胞偏离其静息状态。能够产生和传导兴奋的细胞具有可兴奋性膜（excitablemembrane）,其在静息状态下细胞膜内外具有的电势差称之为静息膜电位。静息态的神经元膜膜的化学特性膜上的离子流动静息膜电位产生的离子基础一、膜的化学特性1，膜两边的盐溶液细胞质和细胞外液水和离子水是一极性溶剂Cation:K+,Na+,Ca2+Anion:Cl-一、膜的化学特性2，磷脂膜一、膜的化学特性3，跨膜蛋白质酶

受体

离子泵

离子通道

离子选择性（ionselectivity）

门控特性(gate)二、膜上的离子流动离子移动所需的外力：1、浓度梯度扩散Diffusion

a.膜两侧具有浓度梯度

b.膜上具有离子通道二、膜上的离子流动离子移动所需的外力：2、电场作用Electricity

a.膜上具有离子通道

b.膜两侧具有电势差

I＝gVI，电流；g，电导；V，电压。三、静息膜电位产生的离子基础1、静息膜电位：Vm

在任何状态下跨神经元膜的电压称为膜电位。典型的神经元的静息膜电位大约为-65mV。

静息膜电位的测量方法三、静息膜电位产生的离子基础2、离子平衡电位Eion平衡某种离子浓度梯度的电位差，简称为平衡电位，是针对某种特定离子的电位，Eion。a、当膜不能通透离子时，虽然有浓度差，但没有离子的流动，故膜电位为零，Vm=0。b、膜上有钾离子通道时，钾离子可以顺浓度梯度流出到胞外，则胞内会有过多的A-，而细胞外就会积聚过多的正电荷K+，则会出现跨膜电位。

c、随着胞内越来越多的负电荷积聚，负电荷就会吸引带正电的钾离子返回胞内。当达到一定的电位差后，吸引K＋回胞内的电势与扩散力刚好相等，但方向相反，就会达到平衡状态。字母大小代表浓度高低三、静息膜电位产生的离子基础2、离子平衡电位Eiona，膜电位的巨大改变是由离子浓度的小变化引起的b，净电荷差发生在膜的内和外表面c，离子被驱动跨膜运动的速率与膜电位和平衡电位之差成正比；（Vm-Eion）被称为离子驱动力d，如果已知某一离子的跨膜浓度差，可以计算其平衡电位跨膜电荷分布三、静息膜电位产生的离子基础计算离子平衡电位的Nernst方程

如果膜两侧存在浓度梯度，且膜只对某种离子通透，则可以得到稳态电位。可以根据Nernst方程计算其平衡电位：

Eion=RT/zF×ln[ion]o/[ion]iR气体常数，T绝对温度，z离子电荷，F法拉第常数，[ion]内外膜离子浓度三、静息膜电位产生的离子基础3、离子的跨膜分布钾离子膜内多，钠钙氯离子膜外多三、静息膜电位产生的离子基础3、离子的跨膜分布离子浓度梯度的建立是因为离子泵的作用。1)Na-Kpump，将钾离子泵进胞内，钠离子泵出胞外。2)Calciumpump，将钙离子泵出到胞外，此外内质网、线粒体、钙结合蛋白等也可以降低胞内钙离子浓度。三、静息膜电位产生的离子基础4、膜在静息状态下离子的相对通透性神经元在静息时，对离子具有选择通透性，假如仅对一种离子通透：

K+，则Vm=Ek+=-80mVNa+,则Vm=ENa+=62mV

实际上Vm～－65mV，介于EK和ENa之间。对钾离子的通透远远大于对钠离子的通透性。三、静息膜电位产生的离子基础4、膜在静息状态下离子的相对通透性C、去极化使钾离子平衡状态被打破，钾离子浓度梯度大于电场作用力，使钾离子流出，与流入的钠电流方向相反，最终达到平衡。此为新的静息膜电位。B、膜上有少部分钠通道开放，钠离子在浓度梯度和电场作用下进入细胞膜内部，细胞开始去极化。A、只对钾离子通透，Vm=Ek神经元静息膜电位的形成三、静息膜电位产生的离子基础4、膜在静息状态下离子的相对通透性当膜电位受几种离子影响的时候，每一种离子对膜电位的影响不仅取决于膜内外的离子浓度，而且也取决于该离子对膜的通透性(permeability,P)。G-H-K

Equation:方程表明：离子浓度越大，通透能力越强，其在维持静息膜电位中就具有更大的作用。*Goldman-Hodgkin-Katz三、静息膜电位产生的离子基础4、膜在静息状态下离子的相对通透性如果某一种离子的通透性远远大于其它离子，Goldman方程等同于Nernst方程。如胶质细胞中PK>>PCl,PNa.AlanHodgkin,BernardKatz测定了几种离子在静息电位的通透能力：PK：PNa：PCl＝1.0:0.04:0.45在动作电位峰值，其通透性为：PK：PNa：PCl＝1.0:20:0.45三、静息膜电位产生的离子基础5、调控细胞外钾离子浓度的重要性静息膜电位受胞外钾离子浓度影响因为神经元膜在静息状态下对钾离子有更高的通透性，使得静息膜电位接近于钾离子平衡电位膜电位对胞外钾离子浓度变化特别敏感。提高胞外钾离子浓度可以使膜电位去极化。三、静息膜电位产生的离子基础5、调控细胞外钾离子浓度的重要性1）胞外钾离子浓度升高将造成细胞去极化，细胞兴奋；2）血脑屏障限制钾离子进入脑部胞外液；3）星形胶质细胞具有空间缓冲胞外钾离子的作用；4）其它可兴奋细胞没有这种保护机制，则钾离子浓度升高可导致心脏停止跳动。三、静息膜电位产生的离子基础5、调控细胞外钾离子浓度的重要性星形胶质细胞调节胞外钾离子浓度的机理：钾离子立体缓冲(Potassiumspatialbuffering)当胞外钾离子浓度升高时，钾离子进入星形胶质细胞，导致胶质细胞去极化。钾离子的进入增加胞内钾离子浓度，继而被延伸的星星胶质细胞突起的网络系统分散到一个很大的区域。三、静息膜电位产生的离子基础5、调控细胞外钾离子浓度的重要性JackKevorkianDr.Death致死注射：1990年4月，JackKevorkian帮助了患有AD的54岁的JanetAdkins结束她的生命。Adkins夫人首先滴注了一种含有麻醉剂的溶液，然后自动转换为氯化钾溶液。麻醉剂可以使Adkins夫人丧失知觉。心脏停止跳动以及死亡是由于氯化钾注射导致的。可兴奋细胞（包括心肌）的功能需要细胞膜在不产生动作电位是维持在静息膜电位水平。由于胞外钾离子浓度大量升高，细胞去极化，没有负的静息膜电位，心肌细胞不再能够产生导致收缩的冲动，心脏就立刻停止了跳动。三、静息膜电位产生的离子基础6、离子通道定义：可以传导离子；识别和选择性传导离子；对特定的电、化学和机械信号作出反应而开放或者关闭通道可被一些药物和毒素等阻断；离子通道的功能失调可导致疾病的发生；三、静息膜电位产生的离子基础6、离子通道结构：

离子通道是由插入膜中形成孔洞的蛋白质组成，由两个或者多个相同或者不同的亚基组成的，某些通道还有调节其功能的附属亚基。

根据相似的氨基酸序列和跨膜结构，离子通道被分为以下三类：配体门控通道(Ligand-gated)、缝隙连接通道(Gap-junction)、电压门控通道(Voltage-gated)。离子通道的结构功能可以通过PatchClamp、Genecloning、X-raycrystallography、NMR、EPR等方法研究。三、静息膜电位产生的离子基础7、多姿多彩的钾离子通道Shaker钾通道钾通道的选择性通透是决定静息膜电位的重要因素，其选择性的分子基础主要是在通道内氨基酸残基的排列。钾通道由四个亚单位所组成。Poreloop去作为选择性滤器使得通道对钾离子有最高的通透性。该区域一个氨基酸的突变就能严重破坏神经元功能。7、多姿多彩的钾离子通道LilyJan&Yuh

NungJan果蝇中有一种突变体Shaker，对乙醚的反应是晃动腿、翅膀和腹部。电生理研究揭示Shaker突变体的钾通道功能异常。利用分子生物学技术，Jan等人绘出了Shaker体内突变的基因。这个Shaker基因编码一种钾通道。三、静息膜电位产生的离子基础7、多姿多彩的钾离子通道钾通道可分为以下几种：1、IK，delayedrectifier,延时整流钾通道，慢激活2、IA，A-type,瞬时钾电流，快激活，快失活3、Ica，Calciumactivated，钙激活钾电流，去极化+钙4、Iir，inward-retifier,内向整流，超极化激活5.IM，M-typechannel,小的去极化激活，Ach失活。三、静息膜电位产生的离子基础7、多姿多彩的钾离子通道钾通道孔道俯视图中间红球为K+三、静息膜电位产生的离子基础7、多姿多彩的钾离子通道三种钾离子通道电压门控内向整流Twoporedomain三、静息膜电位产生的离子基础7、多姿多彩的钾离子通道内向整流钾通道的X-ray衍射结构三、静息膜电位产生的离子基础动作电位动作电位特性理论上的动作电位实际中的动作电位动作电位的传导动作电位、轴突和树突一、动作电位特性1，动作电位的上升相和下降相示波器记录及动作电位的上升和下降相上升相risingphase超射 overshoot下降相fallingphase回射 undershootNa+内流引起去极化K+外流引起复极化动作电位特征的形成原因：

阈值(threshold):足够多的钠通道的开放使钠离子通透性大于钾离子上升相（risingphase)：钠通道完全开放，钠离子迅速进入胞内超射（Overshoot）：趋向于钠平衡电位下降相(fallingphase)：钠通道失活，钾通道开放增加回射（后超级化，undershoot)：接近于钾平衡电位2，动作电位的记录方法胞内记录(Intracellularrecording)胞外记录(Extracellularrecording)复合动作电位记录(CompoundAPrecording)一、动作电位特性3，单个或多个动作电位的产生不同的神经元，去极化以不同的形式引发动作电位：皮肤受刺激，通过牵张敏感的(stretch)钠离子通道；神经递质引起的钠通道开放，如中间神经元；胞内注射电流也可以产生动作电位。“阈值”一、动作电位特性3，单个或多个动作电位的产生动作电位发放频率依赖于去极化电流的强度，即刺激强度被编码为神经冲动频率。发放动作电位的速率是有上限的，最大发放频率大约为1000Hz。一、动作电位特性二、理论上的动作电位1，膜电流和膜电导钠、钾通道关闭Vm=0仅钾通道开放通道开放，有电导，驱动力为Vm-Ek平衡状态Vm=Ek驱动力(Vm-EK)，电流，电导三者之间关系：IK=gK(Vm-EK)Iion=gion(Vm-Eion)2，动作电位过程中离子的进出动作电位可以看做是离子通道的通透性转变导致膜电位的翻转静息状态下，钠离子具有很大的驱动力Vm-ENa=-80-62=-142mV。膜对离子的通透性由钾离子变为钠离子，膜电位可以在极短的时间内逆转。二、理论上的动作电位三、实际的动作电位1，电压钳方法1963NobelPrize要验证理论上的动作电位，可以通过测定在动作电位的不同时期各离子的电导，以期确定钾钠离子及其通道在动作电位产生过程中的作用。测电导的工具，电压钳，就是将膜电位钳制在某一预设数值的装置，由KennethC.Cole发明。50年代，Hodgkin&Huxley用电压钳方法把神经元轴突膜电位钳制在任意数值，然后通过测量在不同膜电位时流过膜的电流来推测膜电导变化。g=I/VAlanHodgkinAndrewHuxley2，膜片钳方法ErwinNeherBertSakmann1991NobelPrize三、实际的动作电位3，电压门控钠通道通道选择性地对钠离子开放，且通道的开放与关闭与膜电位的变化有关。1）钠通道结构一个完整的钠通道是由一条多肽长链组成。除了这个多肽长链组成的α单位以外，还有两个β亚单位(β1,β2）起修饰作用。多肽长链由四个结构域(I-IV)组成，每个结构域含6个跨膜alpha螺旋(S1-S6)。III-IV之间可能调节失活。S4片段上有电压感受器；S5-S6组成通道选择性滤过器。TTX作用位点三、实际的动作电位3，电压门控钠通道2）钠通道开放模式图S4段含有正电荷(每隔两个氨基酸残基就有一个带正电荷的赖氨酸或者精氨酸)，当膜电位发生变化的时候，S4片段便会被迫发生移动，这种构像变化可以引起钠通道开放。三、实际的动作电位3，电压门控钠通道3）钠通道的功能特性开放延时很短暂；开放时间约1ms后失活(inactivation)；失活后继续去极化不能使钠通道再开放；只有当膜电位复极化到阈值附近时，通道才能被去极化再次打开。三、实际的动作电位3，电压门控钠通道4）作用于钠通道的毒素活化阻断剂（阻断钠电流）河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX),特点：作用迅速，可逆石房蛤毒素(Saxitoxin,STX),赤潮中的旋沟藻，专用于对TTX不敏感的钠通道。——在蛤蜊、蚌类及其它海洋壳类动物中常常会因为以原生藻类为食而积聚STX，食用会致命。b.

失活化阻断剂（延长动作电位）海葵毒素(Seaanemonevenom),使开放的钠通道不能立即关闭，继续开放下去，从而使Na离子继续内流，峰值时间延长，形成平台。蝎毒素(Scorpiontoxin),阻止钠通道失活化，动作电位延长。c.

钠通道激动剂（异常开放）

箭毒(Batrachotoxin),哥伦比亚产小蛙皮肤分泌物提取物。使钠通道在更负的水平上开放，开放时间长于正常开放时间。百合科藜芦定（veratridine)或者毛茛科乌头碱(aconitine)与箭毒作用类似。活化阻断剂（阻断钠电流）河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX),特点：作用迅速，可逆石房蛤毒素(Saxitoxin,STX),赤潮中的旋沟藻，专用于对TTX不敏感的钠通道。——在蛤蜊、蚌类及其它海洋壳类动物中常常会因为以原生藻类为食而积聚STX，食用会致命。三、实际的动作电位3，电压门控钠通道d.

毒素的作用特点及功能不同的毒素结合于通道蛋白的不同位点，故不同的毒素结合位点可以帮助我们推断钠通道的三维结构；钠通道毒素可以阻断动作电位的产生，可以用来分离不同的离子电流毒理学研究，当心吃入嘴中的东西。4）作用于钠通道的毒素三、实际的动作电位3，电压门控钠通道局部麻醉剂局部麻醉剂是能够暂时阻断轴突上动作电位的药物，被直接注射到需要局部感觉缺失的组织中。利多卡因是现在最广泛应用的局麻药。它位于通道蛋白质的IV区中的S6alpha螺旋区。小轴突要求更多的电压门控钠通道参与，因此较细的轴突对局麻药更敏感，这在临床上非常有意义。三、实际的动作电位4，电压门控钾通道1）在去极化时，钾通道开放比钠通道稍晚。2）钾通道是由四个独立的多肽亚基组成，4个亚基聚合成一个通道；3）对于钾通道的认识主要来源于Shaker钾通道，多种电压门控钾离子通道三、实际的动作电位5，小结：动作电位特征的形成原因：阈值(threshold):足够多的钠通道的开放使钠离子通透性大于钾离子上升相（risingphase)：钠通道完全开放，钠离子迅速进入胞内超射（Overshoot）：趋向于钠平衡电位下降相(fallingphase)：钠通道失活，钾通道开放增加回射（后超级化，undershoot)：接近于钾平衡电位

绝对不应期(absoluterefractoryperiod)：钠通道失活，不能被激活相对不应期(relativerefractoryperiod)：超极化状态，接近于Ek，需要大的去极化三、实际的动作电位动作电位产生动作电位传导动作电位的传导速度是不相同的，10m/s是比较典型的速率。四、动作电位的传导四、动作电位的传导影响传导速度的因素轴突直径v=κd1/2有无髓鞘，髓鞘厚度myelin

温度的高低髓鞘和跳跃传导朗飞氏结动作电位产生部位：轴丘(axonhillock)-锋电位起始区感觉神经元：锋电位起始区靠近感觉神经末梢一般轴丘上含有较多的电压门控钠通道。五、动作电位、轴突和树突动作电位的发放形式不同与神经元的离子通道种类和数量有关。神经元选择性电行为五、动作电位、轴突和树突五、动作电位、轴突和树突离子通道在神经元细胞上的分布的不同与动作电位传播有关：1）树突：钙、钾、钠；电紧张电位2）triggerzone：高密度钠通道，模拟数字3）轴突：钠通道4）突触前：钙通道六、神经冲动产生和传导（一）神经冲动的产生

外向电流和电紧张性电位1、极性法则

概念：当用短暂的直流电刺激神经时，通常仅在通电和断电时各引起一次兴奋，通电时兴奋发生在阴极部位，断电时则在阳极部位。

原因：当电极置于神经纤维表面通电时，刺激电流在阳极处由膜外流向膜内，再在阴极处由膜内流向膜外，即在阳极处存在着内向电流，在阴极处存在着外向电流。

内向电流造成电压降与膜两侧原有静息电位（内负外正）一致，结果使膜电位数值增大，膜处于超极化状态，即膜兴奋性下降。外向电流造成电压降与膜两侧原有静息电位（外正内负）电压差方向相反，两者互相抵消，结果使阴极下膜静息电位数值减少，处于去极化状态，即兴奋性升高。2、电紧张性电位概念：阈下强度刺激作用所引起的膜电位变化通称为电紧张性电位。特点：●随着刺激强度增强而增大；●按一般电学规律向周围扩布，呈指数衰减。（电紧张性扩布）。（二）局部反应、阈电位和动作电位

1、局部反应外向电流加大到一定程度便可导致神经冲动产生。局部反应与电紧张性电位相同点：局部反应幅度也可随着刺激强度的强弱而增减，并作电紧张性扩布。局部反应特点：不同点：●电紧张性电位完全是由于电刺激造成的去极化（膜电容电流）所引起；●局部反应是由于电刺激造成的去极化和少量Na+内流造成的去极化叠加所引起，是动作电位前身。2、阈电位和动作电位阈电位：当刺激增强到阈值，使膜电位减小到临界水平（神经、肌肉细胞约在-50至-70mv），便爆发动作电位。这一临界膜电位水平称为阈值膜电位或简称阈电位。阈刺激与阈电位关系阈刺激：刺激强度和作用时间等参数足以使膜电位去极化到阈电位的刺激（二）阈下刺激、局部反应及其总和

1、阈下刺激与局部反应单个阈下刺激产生的局部反应可以使膜的兴奋性提高。2、局部反应与总和（1）时间性总和：在膜同一部位相继给予两个阈下刺激，二个阈下刺激引起的局部反应发生叠加，称为时间性总和；

（2）空间性总和：在膜相邻的两个部位同时给予阈下刺激，各自的局部反应发生叠加，称为空间性总和。

局部反应经过总和使静息电位减小（去极化）到阈电位水平，细胞膜可产生一次动作电位。总和现象生理意义在于使局部的兴奋有可能转化为远距离传导的动作电位

阈刺激

细胞兴奋可由两种方式引起

阈下刺激的总和效应二、神经冲动的传导

(一)神经冲动传导机制

传导与传递

当神经纤维某一局部发生兴奋时，膜外为负电位，膜内为正电位，但临近静息部位的膜外仍然是正电位，膜内是负电位。膜外兴奋部位与未兴奋部位之间的电位差形成内向电流；膜内兴奋部位与未兴奋部位之间的电位差形成外向电流。局部电流学说（二）神经冲动的传导方式与速度1、神经冲动的传导方式●有髓神经纤维的传导方式：

跳跃式传导●无髓神经纤维的传导方式：局部产生的动作电位沿膜表面依次传导。2、影响神经纤维传导速度的因素●神经纤维粗细、髓鞘厚度一般说来，神经纤维越粗，髓鞘越厚，其传导速度越快。●温度随着温度降低，传导速度减慢，当温度降低到0℃时，神经纤维兴奋传导就会发生阻滞。（三）神经传导的一般特征

1、生理完整性；2、绝缘性；

3、双向性；4、相对不疲劳性；

5、非递减性●动作电位的幅度不随刺激强度增加而增大；刺激强度使静息电位减小到阈电位水平时爆发动作电位。之后，动作电位幅度、波形以及它在膜上传导情况与原先刺激无关，仅取决于膜本身当时生物物理特性与膜内外离子分布情况。●不随传导距离增加而减小原因：传导通过局部电流引起。2、膜片钳技术及其应用3、膜片钳系统装置1、细胞电生理学1.电生理学——生命科学中的信息科学组织的生物电场信息高级处理细胞的电脉冲信息整合和编码细胞膜的电流电信号发生和传递1.电生理学——生命科学中的信息科学之一离子通道：生物电发生的基本元件，也是重要的药物治疗靶点。组织的生物电场信息高级处理细胞的电脉冲信息整合和编码细胞膜的电流电信号发生和传递2.离子通道：重要的药物靶点2.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础参与维持细胞正常形态细胞兴奋-收缩偶联和兴奋-分泌偶联细胞跨膜信号转导2.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础——静息电位的形成2.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础——动作电位的形成2.1重要的生理功能参与维持细胞正常形态2.1重要的生理功能细胞兴奋-收缩偶联2.1重要的生理功能细胞兴奋-分泌-兴奋偶联2.1重要的生理功能细胞跨膜信号转导2.离子通道：重要的药物靶点2.2关键的药物治疗靶点2002年由FDA提供的分析报告指出，目前所有FDA认可的药品中涉及到的治疗靶点基因仅为273个，其中完全认定为药物靶点的7%为离子通道；2006年的调研表明，配体门控和电压门控的离子通道是第三和第四大现有的可治疗基因家族（仅排在G蛋白基因家族和核受体基因家族之后），分别占据7.9%和5.5%；经典的离子通道类临床用药见表1：药物类别药物靶点药物名称抗高血压药物钙通道硝苯地平西尼地平钾通道尼克地尔抗心律失常药物钠/钾通道奎尼丁钙通道地尔硫桌维拉帕米钾通道胺碘酮麻醉药钠通道利多卡因普鲁卡因氯通道/NMDA丙泊酚镇静/催眠/抗癫痫药物钠通道苯妥英钠卡马西平钙通道乙琥胺钾通道氯丙嗪氯通道苯二氮䓬缺血脑保护药物钙通道氟桂利嗪钠通道利法利嗪钾通道氟芬那酸糖尿病药物钾通道优降糖、达美康表1.离子通道：重要的药物靶点3.离子通道——分类分类方法具体类别电压门控性，voltagegated又称电压依赖性(voltagedependent)或电压敏感性(voltagesensitive)离子通道:因膜电位变化而开启和关闭，以最容易通过的离子命名，如K+、Na+、Ca2+、Cl-通道4种主要类型，各型又分若干亚型.配体门控性，ligandgated又称化学门控性(chemicalgated)离子通道，由递质与通道蛋白质受体分子上的结合位点结合而开启，以递质受体命名，如乙酰胆碱受体通道、谷氨酸受体通道、门冬氨酸受体通道等.非选择性阳离子通道(non-selectivecationchannels)系由配体作用于相应受体而开放，同时允许Na+、Ca2+

或K+

通过，属于该类.机械门控性，mechanogated又称机械敏感性(mechanosensitive)离子通道:是一类感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道，根据通透性分为离子选择性和非离子选择性通道，根据功能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道.基因相似性根据基因序列的相似性或同源性而归类的离子通道，例如TRP家族等。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性，即细胞静息电位的钾离子学说；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代做出了开创性研究。他们基于电压钳技术，提出并验证了所谓的Hodgkin—Huxley方程，数学模拟出和真实状况相符合的神经冲动的传导，由此建立了细胞动作电位的钠离子学说。离子通道的近代观念也由此产生。4.离子通道研究理论4.离子通道研究技术微电极电压钳-电流钳技术传统膜片钳技术ErwinNeher(1944-)KennethCole(1900-1984)表2.膜片钳技术的历史角色年份电生理学中标志性事件1786LuigiGalvani首次在蛙类体内发现生物电现象，电生理学的创始人，1887SidneyRinger发明了蛙心灌流试验用的溶液。1888WaltherNernst提出了Nernst方程。1902JuliusBemstein

提出静息电位的K+学说。1937Renshaw

首次使用微电极成功记录到了脊髓中间神经元的电活动。1946Gerard首次使用微电极测定了蛙肌细胞膜电位。1949Ling发明了微电极细胞内记录技术，Cole首创的电压钳技术问世，成为电生理学史上重要的里程碑，电生理研究进入细胞时代。1949Hodgkin和Katz提出了动作电位Na+学说。1952Hodgkin和Huxley分离出Na+、K+电流和漏电流。1953Fatt和Katz分离出了Ca2+电流。1964Deck、Kern和Trantwein在浦肯野氏纤维上进行电压钳研究。1976E.Neher和B.Sakmann创立了膜片钳技术，使电生理研究空前活跃，并作为重要的里程碑，标志着电生理分子时代的到来。1980~膜片钳技术、生物大分子技术以及生物光学技术的结合，使人们对生物电现象的认识水平在分子水平取得了重大的突破和丰富。5.传统膜片钳设备的组成电学部分信号放大器数据采集卡

PC

周边设备控制器等光学部分：荧光显微镜

CCD照相机监视器激光器等机械部分防震台，气压泵或气瓶高精密微电极操作器灌流操作器显微镜移动平台或可移动载物台辅助部分：信号屏蔽罩微电极拉制仪药物灌流设备温度控制器2、膜片钳技术及其应用3、膜片钳系统装置1、细胞电生理学膜片钳实验室基本设备膜片钳放大器信号转换器倒置显微镜微操纵器防震工作台及静电屏蔽笼微电极拉制仪及抛光仪计算机专用软件细胞记录槽恒速灌流泵FaradaycageVibrationIsolationTableMicroscopeMicro-ManipulatorsRemoteControllerAmplifiersCCDCameraMicro-ManipulatorsDAD-VCsystemCCDCameraElectrophysiology-ApparatusElectrophysiology-ApparatusPatchclamp膜片钳记录的基本步骤可概括为4大部分：1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持2个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有：急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。当根据不同的研究要求而相应选择。3.膜片钳记录4.资料分析用相应的计算机软件进行3.膜片钳记录电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在0.5-2.0μm之间，是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压，在倒置显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆封接就必须做到：1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅；4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之；5)细胞膜清洁，活性好。

4.资料分析一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型(簇状猝发，Burst)样开放与闪动样短暂关闭(flickering)，化学门控性通道的开、关速率常数等。药理学研究：研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。综合分析得出最后结沦．膜片钳在药理学研究中的应用膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革命性意义，而且开辟了一条探索药物作用机制和发展新的更为有效药物的途径。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。

膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。药物作用机制研究膜片钳技术对离子通道的动力学研究以及药物与通道相互作用机制的研究。药物对通道电压依赖的激活和灭活过程的影响药物对离子通道状态依赖性的作用（如大多数Ⅰ类抗心律失常药与失活状态的Na+通道结合而发挥作用）。药物的频率依赖性（frequency-dependent）或使用依赖性（use-dependent）（如维拉帕米）以及药物对离子通道亚型的选择性作用等。膜片钳技术还在作用于通道活性受体和第二信使调节的药物的机制研究中发挥了重要作用。如证明了肾上腺素能介质及药物激活β受体后，通过第二信使cAMP激活蛋白激酶A，使钙通道磷酸化，由关闭状态转为开放。

新药开发

在现代药物研究中，新靶点的建立往往是新药创制的前提。随着膜片钳技术运用对许多新受体亚型的发现和特性研究，新型受体阻断剂将在选择性

、高效性上发挥更大的作用。

近十年来药物学研究最重要的成就之一就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和维拉帕米及其衍生物)。研制出钾通道开放剂（nicorandil、pinacidil等）

Ⅲ类抗心律失常新药是近年来心血管药理的重要研究方向。离子通道病及与离子通道调节缺陷有关疾病的研究。将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道的功能而达到治疗的目的。

离子通道药理学Patch-clamp技术新药开发Na+,Ca2+,K+,Cl-等电流分子生物学技术单细胞电流记录离子通道的结构与功能药物作用机制基因克隆及蛋白表达通道蛋白功能测定一、离子选择性(selectivity)（大小和电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：K>Na100倍、兴奋：Na>K10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Gating)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。开放

状态openstate

失活状态Inactivestate

静息

状态restingstate激活activation失活

inactivation复活

recovery二、离子通道的特性

(CharacteristicofIonChannels)一、离子选择性(selectivity)（大小和电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：K>Na100倍、兴奋：Na>K10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Gating)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。三、离子通道的功能

(FunctionofIonChannels)1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、学习和记忆3.维持细胞正常形态和功能完整性

膜离子通道的基因变异及功能障碍与许多疾病有关，某些先天性与后天获得性疾病是离子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子通道病(ionchannelpathies)。四、离子通道的分类（一）、非门控离子通道（背景或漏通道）：始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号的明显影响，如产生静息电位的K+通道。（二）、门控离子通道：①电压门控（Voltagegatedchannels)离子通道：受膜电位的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。②配体门控（Ligandgatedchannels)离子通道：由递质与通道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。③机械门控离子通道(Mechanicallygatedionchannels)：由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。电压门控离子通道的分子结构示意图

亚基(,,等）α亚基的四个跨膜区（D1-D4）S1

S2

S3

S5

S6

S4

电压感受器（voltagesensor）

孔道区（poreregion）6个呈α螺旋式的跨膜片断（transmembranesegments,S1-S6）

离子通道的晶体结构与模型

钾离子孔道螺旋选择性过滤器NC（一）电压门控离子通道的分类钠通道神经类钠通道骨骼肌类钠通道心肌类钠通道(持久、瞬时)钙通道L-型（心肌窦房结、房室结）；T-型（心脏传导组织）；N-型（中枢神经系统神经元和突触部位）；P-型（大脑）；Q-型（小脑、海马、脊髓）；R-型（神经细胞）钾通道瞬时外向钾通道(Ito)延迟整流钾通道(IK)内向整流钾通道(IK1)起搏电流(If)快反应细胞APandIonchannels01234INaICaIKrIKsIK1IK1IToINa-CaIto1Ito21.电压门控钠通道选择性允许Na+跨膜通过。维持细胞膜兴奋性及其传导（AP的0相）。存在于心房、心室肌细胞和希普系统。特征电压依赖性：去极化激活，产生内向钠电流（INa）快速激活（1ms）和快速失活（10ms）有特异性激活剂（BTX、GTX）和阻滞剂（TTX、STX、μCTX）电压门控钠通道分类神经类钠通道（对TTX敏感性高、对μCTX敏感性