基因工程制药技术-课件

第三章基因工程制药技术1ppt课件2第一节

概述

2ppt课件基因工程

将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作过程。基因工程药物

采用基因工程的技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主，所生产的作为治疗、诊断等用途的多肽和蛋白质类药物称为基因工程药物。3ppt课件基因工程药物通常分为4类：激素和多肽类、酶、重组疫苗、单克隆抗体人胰岛素（Insulin）4ppt课件3DStructureofInsulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer）5ppt课件基因工程制药的发展

美国是应用现代生物技术研制新型药物最多的国家，其基因工程药物的研发也处于世界先进水平。1971年，第一家生物制药公司Cetus在美国成立。目前美国已经有1300多家生物技术公司.1982~1998年的16年时间里，已经有53种基因工程药物获得FDA批准上市，广泛应用于治疗癌症、多发性硬化症、糖尿病、肝炎及一些罕见的遗传性疾病。6ppt课件我国基因工程发展的现状

第一个在我国生产的基因工程药物——重组人干扰素α1b

第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物。

目前我国已有15中基因工程药物和若干种疫苗批准上市。7ppt课件8第二节

重组DNA技术的基本过程8ppt课件9基本过程（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。

9ppt课件重组DNA技术的特点：1不受亲缘关系的限制，打破物种界限；2定向地改变物种的遗传特性；3增加目的基因的含量，提高基因产物的水平。1010ppt课件质粒DNA外源DNA酶切酶切质粒染色体引入受体由细胞分裂来增殖基因工程操作过程模式图11ppt课件基因的表达系统：12原核生物系统真核生物系统12ppt课件基因表达系统的选择：1、要保证所表达蛋白的功能；2、蛋白表达量的多少和分离纯化的难易。1313ppt课件原核目的基因的获得基因组DNA文库的建立

用限制性内切酶对细胞总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片段分别克隆进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进行鉴定、分离，再培养和进一步鉴定。1414ppt课件15cDNA文库

纯化目的mRNA，逆转录成cDNA①mRNA的分离②cDNA第一链的合成③cDNA第二链的合成④cDNA与载体连接⑤转染或转化⑥筛选目的克隆15ppt课件真核目的基因的获得真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中的很小一部分，从染色体中直接分离纯化目的基因难度很大。而且真核基因含有内含子，即使将其导入了原核细胞，由于缺乏相应的细胞器对mRNA进行加工，也不能对其进行克隆。16获得方法反转录法化学合成法16ppt课件反转录法

先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。1717ppt课件化学合成法

在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。1818ppt课件19PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）

典型PCR反应包括：①模板变性

94℃以上(1～2’)②退火

50～55℃(1～2’)③延伸

72℃(1～2’)在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5’→3’延伸。19ppt课件20PCR20ppt课件目的基因的表达目的基因所携带的遗传信息，经过极其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质的过程。21原核细胞eg.大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌等真核细胞eg.酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞等宿主细胞21ppt课件宿主细胞显微镜下照片2222ppt课件23第三节

基因工程工具酶和克隆载体23ppt课件基因工程的常用酶基因工程的操作依赖一些工具酶对基因进行人工切割和拼接等操作。24限制性内切酶连接酶修饰酶24ppt课件识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列的NDA水解酶称为限制性内切酶。Ⅱ类限制性内切酶的主要作用是切割DNA分子，便于对含有特定基因的DNA片段进行分离和分析，是基因工程中使用的主要的工具酶。2525ppt课件回文序列A

palindromicsequence

isa

nucleicacid

sequence(DNA

or

RNA)thatisthesamewhetherread5'(five-prime)to3'(three-prime)ononestrandor5'to3'onthe

complementarystrand

withwhichitformsa

doublehelix5'-GAATTC-3'3'-CTTAAG-5'2626ppt课件粘性末端2727ppt课件连接酶：将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。具有分子“缝合”作用。可催化DNA片段的5’磷酸基与3’羧基之间形成磷酸二酯键，连接时需要ATP作为辅助因子。2828ppt课件其他工具酶：DNA聚合酶，反转录酶，T4多核苷酸激酶，碱性磷酸酶等。2929ppt课件克隆载体外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动物受体细胞，这种能承载DNA片段并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体。基本条件：1.能够进入宿主细胞；2.可以在宿主细胞中独立复制；3.有筛选标记；4.有单一或较少的酶切位点。分为三大类：1.克隆载体2.穿梭载体3.表达载体目前已构建应用的基因工程载体：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、以及由它们相互组合或与其他基因组DNA组合成的载体3030ppt课件适用于将外源基因导入细胞中复制扩增。一般特征：分子量小，多拷贝，松弛性；具有多种常用的限制性内切酶的单切点；能插入较大的NDA片段；容易被检测，如具有抗性基因等。31克隆载体31ppt课件克隆载体1.细菌质粒：是重组DNA技术中常用的载体。常用的有：F因子、R因子、大肠埃希菌菌素因子。可以克隆的DNA最大片段一般在10KB左右。2.噬菌体载体：可以克隆更大一些的DNA片段。3.柯斯质粒：能插入40-50KB的外源DNA，常用于构建真核生物基因组文库。3232ppt课件33E.coli33ppt课件3434ppt课件表达系统3535ppt课件36表达系统36ppt课件37大肠埃希菌表达载体主要包括：启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及筛选标记基因等。

37ppt课件大肠杆菌和真核细胞表达系统比较3838ppt课件39第四节

基因工程药物的生产39ppt课件40基因工程菌株（细胞）培养与发酵的目的：希望其外源基因可以高水平表达，获得大量的外源基因产物。外源基因的高效表达，则与宿主、载体、克隆基因及所处的环境条件密切相关。40ppt课件41质粒不稳定分裂不稳定结构不稳定

为了提高工程菌质粒的稳定性，其培养一般采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长到一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。

通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。41ppt课件基因工程菌株的培养1.培养基的组成2.培养温度3.培养方式：分批培养、补料分批培养、连续培养、透析培养4242ppt课件基因工程菌发酵条件1.培养基碳源、氮源、无机盐、微量元素生物素等。2.接种量

移入种子液体积和培养液体积的比例。3.温度

对基因表达的调控可发生在复制、转录、翻译或调节分子的合成等水平上。还影响蛋白质的活性和包涵体的形成。4.溶解氧

对菌体的生长和产物的生成影响很大。5.pH

细胞生长期的最佳pH范围是6.8～7.4。

外源蛋白表达的最适pH为6.0～6.5。4343ppt课件①目标产物的初级分离，主要是在细胞培养后，将细胞从培养液中分离出来，然后再破碎细胞释放产物、溶解包涵体、复原蛋白以除去大部分杂质；②目标产物的纯化，是在分离的基础上，用各种具有高选择性的精密仪器，使产物按要求进行纯化。44基因工程药物的分离纯化44ppt课件基因工程药物的分离纯化（一）影响基因工程产物分离纯化工艺的主要因素1.产物活化、纯度和杂质2.产物表达形式和表达水平3.产物本身的分子特性4.产物用途和需求量4545ppt课件基因工程药物的分离纯化（二）主要的分离技术1.离心初步实现固液分离。2.沉淀不同条件下蛋白质溶解度不同，对其进行沉淀分离。3.膜分离利用半透膜对不同组分进行分离。4.双水相萃取水相中加入溶于水的高分子化合物（PEG和葡聚糖），通过蛋白在两相（盐相，高分子相）中的溶解度不同进行分离。5.反胶束萃取4646ppt课件基因工程药物的分离纯化（三）纯化方法1.离子交换层析2.凝胶过滤层析3.反相层析4.疏水层析5.亲和层析4747ppt课件4848ppt课件各种产物表达形式采用的分离纯化方法（一）细胞内不同性表达产物——包涵体1.菌体细胞的收集与破碎2.包涵体的分离洗涤与溶解3.变性蛋白的纯化4.重组蛋白的复性4949ppt课件50包涵体电镜图大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包涵体50ppt课件5151ppt课件52（二）分泌性表达产物体积大，浓度低，需在纯化前进行浓缩处理。浓缩的方法包括沉淀和超滤等。（三）大肠埃希菌细胞内可溶性表达