色谱分析导论

*1第六章

色谱分析导论

Introductionto

chromatographanalysis

*2§6-1色谱法概述Generalizationofchromatographanalysis§6-2色谱理论根底Fundamentalofchromatographtheory*3第一节色谱法概述一、色谱法的特点、分类和作用characteristic,classificationactuationofchromatograph二、气相色谱别离过程separationprocessofgaschromatograph三、色谱流出曲线与根本术语Chromatogramandnamewords

generalizationofchromatographanalysis

*4一、色谱法的特点、分类和作用

1.概述混合物最有效的别离、分析方法。俄国植物学家茨维特〔Tswett)在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱法是一种别离技术。试样混合物的别离过程也就是试样中各组分在称之为色谱别离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体〔气体或液体〕，称为流动相。*5色谱法原理

当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复屡次的分配平衡，使得各组分被固定相保存的时间不同，从而按一定次序从色谱柱中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的别离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的根底*62.色谱法分类

按流动相的状态不同主要分为两类：(1)气相色谱：流动相为气体〔称为载气〕。按别离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱*7(2)液相色谱：流动相为液体〔也称为淋洗液〕。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。*8(3)其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱:CO2流动相。高效毛细管电泳:九十年代快速开展、特别适合生物试样分析别离的高效分析仪器。*93.色谱法的特点〔1〕别离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。〔2〕灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。〔3〕分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。〔4〕应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的别离分析。缺乏之处：被别离组分的定性较为困难。*10二、色谱别离过程色谱别离过程是在色谱柱内完成的。以气相色谱为例。气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的别离机理不同。气固(液固)色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液(液液)色谱的固定相:由担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的别离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的别离机理：溶解与挥发的反复屡次分配过程。*11气相色谱别离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。*12三、色谱流出曲线与术语1.基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.色谱峰当某组分从色谱柱流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线称为该组分的色谱峰。3.峰高(h)色谱峰顶到基线的垂直距离。*134.保存值表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。〔1〕时间表示的保存值保存时间〔tR〕：组分从进样到柱后出现浓度极大值〔即色谱峰顶值〕时所需的时间；〔动画〕调整保存时间〔tR＇〕：tR＇=tR－t0死时间〔t0〕：不与固定相作用的气体〔如空气〕的保存时间；*14〔2〕用体积表示的保存值保存体积〔VR〕：VR=tR×F0F0为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。死体积〔V0〕：V0=t0×F0调整保存体积(VR＇)：VR＇=VR－V0〔动画〕*155.相对保存值r2，1组分2与组分1调整保存值之比：r2，1=t´R2/t´R1=V´R2/V´R1相对保存值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。所以又称为选择因子。*166.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：〔1〕标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。〔2〕半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354〔3〕峰底宽(Wb)：Wb=4*177.色谱流出曲线的数学描述

色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为：

当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰减函数构建关系式。*18色谱流出曲线的意义由色谱流出曲线可以实现以下目的：〔1〕根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含组分的最少个数。〔2〕根据色谱峰的保存值进行定性分析。〔3〕依据色谱峰的面积或峰高进行定量分析。〔4〕依据色谱峰的保存值以及峰宽评价色谱柱的别离效能。*19选择内容：第一节色谱法概述generalizationofchromatographanalysis第二节色谱理论根底fundamentalofchromatographtheory结束*20第二节色谱理论根底一、塔板理论platetheory二、速率理论ratetheory三、别离度resolutionfundamentalofchromatographtheory

*21一、塔板理论

〔一〕分配过程

1.分配系数〔partionfactor〕K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时的浓度〔单位：g/mL〕比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱别离的依据。*22分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；同一个组份在不同的固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善别离效果；试样中的各组分具有不同的K值是别离的根底；某组分的K=0时，即不被固定相保存，最先流出。*232.分配比〔partionradio〕k在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时的质量比：1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随别离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保存能力的参数，数值越大，该组分的保存时间越长。3.分配比可以由实验测得。分配比也称：

容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；*24〔1〕容量因子与分配系数的关系式中β为相比，即β=Vm/Vs。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保存时间越长。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同:气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂外表容量；*25〔2〕分配比与保存时间的关系某组分的k值可由实验测得，等于该组分的调整保存时间与死时间的比值：〔3〕分配系数K及分配比k与选择因子r2,1的关系如果两组分的K或k值相等，那么r2,1=1，两组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，那么别离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱别离的先决条件。*26根本保存方程可表示为：tR=t0(1+k)假设载气流量F0恒定，也可用保存体积表示，那么VR=Vm+KVs这就是色谱根本保存方程。上式说明，色谱柱确定后，Vm和Vs即为定值。由此可见，分配系数不同的各组分具有不同的保存值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。〔4〕根本保存方程*27例：用一根固定相的体积为0.148mL，流动相的体积为1.26mL的色谱柱别离A,B两个组分，它们的保存时间分别为14.4min，15.4min，不被保存组分的保存时间为4.2min，试计算：

〔1〕各组分的容量因子

〔2〕各组分的分配系数

〔3〕AB两组分的选择因子rB,A解：〔1〕kA=(14.4min-4.2min)/4.2min=2.43kB=(15.4min-4.2min)/4.2min=2.67K=kβ=kVm/VsKA=kAVm/Vs=2.43×1.26mL/0.148mL=20.7KB=kBVm/Vs=2.67×1.26mL/0.148mL=22.7(3)rB,A=KB/KA=22.7/20.7=1.10*28色谱理论色谱理论需要解决的问题：色谱别离过程的热力学和动力学问题。影响别离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与别离度的评价指标及其关系。组分保存时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保存时间：色谱过程的热力学因素控制；〔组分和固定相的结构和性质,如分配系数〕色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；〔两相中的运动阻力，扩散〕两种色谱理论：塔板理论和速率理论；*29塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速到达；这一小段间隔的柱长称为理论塔板高度。(2)将载气看作成脉动〔间歇〕过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。〔二〕塔板理论-柱别离效能指标1.塔板理论〔platetheory〕半经验理论；将色谱别离过程比较作蒸馏过程，将连续的色谱别离过程分割成屡次的平衡过程的重复〔类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程〕；在每一个塔板上，被别离组分到达一次分配平衡。〔动画〕*30色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离〔理论塔板高度〕：H，色谱柱的理论塔板数：n，那么三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保存时间包含死时间，在死时间内不参与分配!单位柱长的塔板数越多，说明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。*312.有效塔板数和有效塔板高度组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：*32例：用一根柱长为1m的色谱柱别离含有A，B，C，D四个组分的混合物，它们的保存时间tR分别为6.4min,14.4min,15.4min,20.7min,其峰底宽Wb分别为0.45min,1.07min,1.16min,1.45min。

试计算：各谱峰的理论塔板数。解：*333.塔板理论的特点和缺乏(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能那么越高，即使分配系数只有微小的差异，仍可获得好的别离效果。所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被别离组分的实际别离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法别离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效〔如塔板高度H〕的因素及提高柱效的途径。*34二、速率理论-影响柱效的因素1956年荷兰学者范弟姆特〔VanDeemter)等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系。1.速率方程〔也称范.弟姆特方程式〕H=A+B/u+C·uH：理论塔板高度;u：载气的线速度(cm/s)减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最正确流速；A、B、C三项常数各与哪些因素有关？*35A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，A项为零。〔动画〕*36B/u—分子扩散项B=2γDgγ：弯曲因子，空心毛细管,γ=1；填充柱色谱,γ<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数〔cm2·s-1〕(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，别离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数Dg与组分及载气的性质有关：Dg∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。Dg∝〔M组分〕-1〔5〕扩散系数Dg随柱温升高而增加。〔动画〕*37

k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。C·u—传质阻力项传质阻力系数包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL系数即：C=〔Cg+CL〕〔动画〕*382.载气流速与柱效——最正确流速载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲线与最正确流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最正确流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有零值点。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最正确流速。*39最正确流速uopt与最小理论塔板高度Hmin*403.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间到达等因素是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱别离和操作条件选择提供了理论指导。说明了流速和柱温对柱效及别离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最正确条件，才能使柱效到达最高。*41三、别离度塔板理论和速率理论都难以描述难别离物质对的实际别离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全别离。难别离物质对的别离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保存值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱别离中的四种情况如下图：*42讨论：色谱别离中的四种情况的讨论：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全别离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，根本上完全别离；③柱效较低，△K较大,但别离的不好；④△K小，柱效低，别离效果更差。*43别离度的表达式：别离度同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标.定义为相邻两组分色谱峰保存值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和一半的比值。*44R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min*45R=0.8：两峰的别离程度可达89%，有局部重叠；R=1：别离程度98%；R=1.5：达99.7%〔相邻两峰完全别离的标准〕。*46色谱根本别离方程式R的定义并未反映影响别离度的各种因素。也就是说，R未与影响其大小的因素：柱效n、选择因子和保存因子k联系起来。对于相邻的难别离组分，由于它们的分配系数K相差小，可合理假设k1k2=k，W1W2=W。因此可导出R与n、和k的关系：*47*48讨论：〔1〕别离度与柱效的关系〔柱效因子n)别离度与柱效因子n的平方根成正比，r2,1一定时，增加柱长以增加柱效n，可提高别离度，但组分保存时间增加且峰扩展，分析时间长。增加n值得另一方法是减小柱的H值〔2〕别离度与选择因子r2,1的关系增大r2,1是提高别离度的最有效方法，计算可知，在相同别离度下，当r2,1增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大r2,1的最有效方法是选择适宜的固定相。*49(3)别离度R分配比k的关系k增加，别离度R增加，但当k>10，那么R的增加不明显。通常k在2~10之间。改变k的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。*50色谱别离中的问题由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使局部待测物得到好的别离，但同时又使其它待测物的别离不令人满意！实际工作中采用程序升温〔GC〕和梯度淋洗〔LC〕来解决这个问题。*51分析时间t

分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。其值为可见，分析时间与R，，k、H/u等参数有关。R增加1倍，分析时间那么是原来的4倍。实际工作中，即要能获得有效的别离，又要在较短时间内完成分析。*52

色谱的定性分析色谱的定性分析〔1〕将物直接和未知物对照进行定性〔2〕利用文献的保存数据进行定性〔3〕利用经验规律定性〔4〕与化学方法结合定性〔5〕与其它仪器连用进行定性色谱的定性分析：是指确定试样的组成，即确定每个色谱峰代表什么组分。*53色谱的定量分析色谱的响应信号：色谱的响应信号是峰高或峰面积。一般来说，峰面积的大小不受操作条件如柱温、流动相的流速、进样速度等条件的影响，从这一点来说，峰面积更适合于定量分析。标准曲线法标准参加法*54请选择内容：第一节色谱法概述generalizationofchromatographanalysis第二节色谱理论根底fundamentalofchromatographtheory结束*55色谱法液相色谱法气相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法*56色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保存值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保存值或区域宽度——色谱柱别离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选