种子的扩大培养

关于种子的扩大培养第1页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定发酵产量高、数量充足、无污染的生产菌种的过程。第一节种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养第2页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三种子扩培的目的

接种量的需要

菌种的驯化

缩短发酵时间、保证生产水平第3页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三作为种子的准则细胞生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。第4页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三4.1种子的制备工艺第5页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三第6页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三实验室阶段：所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂中培养过程一般都在菌种室完成。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理。第7页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三第8页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三一、实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法，获得菌丝体，作为种子。

第9页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三①、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5

琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时

对于不产孢子和孢子发芽慢的微生物——获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。第10页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三②.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，

K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基

对于不产孢子和孢子发芽慢的微生物第11页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三③.二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基第12页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三④种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛第13页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三

获得一定数量和质量的孢子

与菌丝体培养相比步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。

对于产孢子的微生物

获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。第14页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三2、培养基选择的原则

有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。

在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。第15页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三二、生产车间种子制备

种子罐的培养基成分原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。第16页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。

缩短发酵时间

有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：第17页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，培养基首先考虑有利于孢子的发育和菌体的生长，营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，基本接近于发酵培养基:

一是成本二是驯化第18页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三例：柠檬酸发酵

以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%第19页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三3、种子罐的作用：使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。第20页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三种子罐级数：指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积

4、种子罐级数的确定

第21页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵

一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数第22页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三发酵级数确定的依据

级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响

级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面第23页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子第24页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。

确定种子罐级数需注意的问题第25页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三5、接种量的确定

移入种子的体积接种量＝—————————

接种后培养液的体积接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据接种量的大小直接影响发酵周期。第26页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。第27页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响杨博，中国油脂，2002第28页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三研究发现，采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。第29页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三

不同接种量影响菌体的生长和发酵第30页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率第31页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好第32页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三6、种龄指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。第33页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三大量地接入培养成熟的菌种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会第34页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三舒琴，林产化学与工业，2004镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期

30小时开始出现芽孢第35页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三4.2影响种子质量的因素原材料质量培养温度湿度通气与搅拌斜面冷藏时间培养基pH第36页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三原材料质量原材料质量波动引起种子质量不稳定原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。第37页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三培养温度温度过低，菌种生长发育缓慢温度过高会使菌丝过早自溶在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。第38页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三湿度湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少第39页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三通气与搅拌足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。丝状微生物不宜剧烈搅拌。第40页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三斜面冷藏时间对孢子的生产能力有较大影响冷藏时间越长，生产能力下降越多链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％，比冷藏3个月的降低35％。第41页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三培养基培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。第42页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；应考虑与发酵培养基的主要成分相近。种子培养基特点第43页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三pH选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境第44页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三种子质量的控制措施菌种稳定性的检查测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮提供适宜的生长环境种子无杂菌检查，保证纯种发酵。

种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等第45页，讲稿共48页，2023年5月2日，星期三三、种子质量标准1、细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有