生物制品制造新技术

关于生物制品制造新技术第1页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三教学目的与要求掌握基因工程疫苗的原理，了解基因工程疫苗的概念与进展。了解生物技术诊断制剂，掌握这些生物技术诊断制剂的原理了解抗体工程的种类。第2页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三Introduction疫苗技术的3个阶段：第一次革命：经典的微生物疫苗时代：19世纪到20世纪第二次革命：20世纪70年代生物技术的出现：重组DNA技术为代表的基因工程疫苗时代第三次革命：20世纪90年代的DNA疫苗时代第3页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三重组DNA技术产生基因工程疫苗：重组亚单位疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗和DNA疫苗等疫苗；生物技术诊断抗原制剂，如基因工程抗原、核酸探针、PCR和基因芯片等的制造新技术，抗体工程技术。治疗性疫苗、肿瘤疫苗和生理调控疫苗等。反向遗传学疫苗研制途径。第4页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三第一节、基因工程疫苗基因工程疫苗：指用重组DNA技术研制的疫苗。重组亚单位疫苗、活载体苗、基因缺失疫苗，裸露DNA疫苗等。新途径，新希望，受到重视。第5页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三一、重组亚单位疫苗（recombinantsubunitvaccines)

用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成生物制品，叫基因工程重组亚单位疫苗。第6页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三原理选择合适的表达系统PCR扩增保护性抗原的基因重组DNA：把抗原的基因亚克隆到表达载体重组表达质粒导入系统的宿主细胞鉴定和选择表达所需细胞培养繁殖制备疫苗第7页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三生产重组亚单位疫苗的表达系统：原核表达系统：大肠埃希氏菌（E.coli）和枯草杆菌（Bacillussubtilis）表达系统。（最常用），其他如：链霉菌基因表达系统等真核表达系统：如酵母表达系统；昆虫基因表达系统；丝状真菌基因表达系统；哺乳动物细胞表达系统植物表达系统参考：基因工程原理。第8页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三重组亚单位疫苗的优点：安全性好，无感染，可用于不宜使用活疫苗动物，如妊娠动物。减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑制原和其它有害的反应原。稳定性好，便于保存和运输，可与感染产生的免疫应答相区别，适合疫病的控制和消灭计划。成功例案：首次：口蹄疫基因工程亚单位疫苗；人乙型肝炎基因工程亚单位疫苗，广泛应用。预防仔猪和犊牛下痢的大肠杆菌菌毛基因工程重组亚单位疫苗。第9页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三二、重组活载体疫苗（live,vectoredvaccines)定义：用基因工程技术将保护性抗原基因（目的基因）转移到载体中使之表达的活疫苗。分类：重组载体病毒活疫苗、重组载体细菌活疫苗细菌载体，沙门氏菌、大肠杆菌等；病毒载体：痘病毒，腺病毒和疱疹病毒等。例子：国外：腺病毒为载体的乙肝疫苗、以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗等。优点：活载体疫苗具有传统疫苗的许多优点，而且又为多价苗和联苗的生产开辟了新路，是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。

第10页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三(非复制性疫苗，又称活-死疫苗：与重组活载体疫苗类似，但载体病毒接种后只产生顿挫感染，不能完成复制过程，无排毒的隐患，同时又可表达目的抗原，产生有效的免疫保护。如用金丝雀痘病毒为载体，表达新城疫病毒HF基因，用于预防鸡的新城疫。)第11页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三重组活载体主要包括病毒、细菌，详见表5.1。第12页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（一）重组载体病毒活疫苗

病毒载体两种：A：复制缺陷性载体病毒，只有通过特定转化细胞的互补作用或通过辅助病毒叠加感染才能产生传染性后代；B：具有复制能力的病毒，如疱疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作为外源基因的载体而保持其传染性。第13页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三例子：利用鸡痘病毒为载体，国内外已成功表达了流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、狂犬病病毒、传染性支气管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美尔球虫等的保护性抗原基因，其中部分产品已正式注册。图5.1概括了重组病毒活载体构建策略与原理。第14页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三第15页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（二）重组载体细菌活疫苗

优点：细菌载体本身起佐剂作用，刺激产生强的B细胞和T细胞免疫应答。口服沙门氏菌疫苗还能刺激黏膜免疫，如把志贺氏菌、霍乱弧菌和大肠埃希氏菌的抗原基因导入沙门氏菌表达。研究少，涉及细菌多基因，较困难，如细菌外膜其他结构：黏附分子侵袭蛋白和鞭毛脂多糖等复杂，如LPS表达涉及30多个基因的级联反应。代表：疫苗株沙门氏菌、李斯特氏菌和卡介苗、痢疾菌等。第16页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三三、基因缺失疫苗（genedeletedvaccines)定义：用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的活疫苗。该技术策略如下图第17页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三基因缺失疫苗优点：安全性好、不易返祖；免疫力坚实，免疫期长，适于局部接种，诱导产生黏膜免疫力。例子：如霍乱弧菌苗；大肠杆菌苗；伪狂犬病毒基因缺失疫苗第18页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三四、基因疫苗（geneticvaccines)

包括DNA疫苗和RNA疫苗，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。基因疫苗研制的基本步骤是：①目的基因的分析；②选择合适的表达载体；③测序确认编码序列；④体外转录／翻译验证试验；⑤动物试验；⑥结果评价等。

顾虑:是否与细胞染色体组整合，抗DNA免疫反应的可能影响；免疫耐受；免疫效力如何进一步提高等。第19页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三五、多肽疫苗（peptidevaccines)定义：用化学合成法或基因工程手段合成病原微生物的保护性多肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。优点：可在同一载体上连接多种保护性肽链或多个血清型的保护性抗原肽链，一次免疫就可防几种传染病。例子：最早报道（1982)成功的是口蹄疫多肽疫苗，还有乙型肝炎和疟疾合成肽疫苗。第20页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三六、转基因植物疫苗（transgenicplantvaccine)

又称为食用疫苗（ediblevaccine）

两种表达系统：整合表达系统，把编码病原体保护性抗原基因导入植物细胞内，并整合到植物细胞染色体上，整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株。这些植株在生长过程中可表达出疫苗抗原，并把这种性状遗传给子代，形成表达疫苗的植物品系。瞬时表达系统，利用重组植物病毒为载体，将编码疫苗抗原的基因插入植物病毒基因组中，再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配并高效表达。第21页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三第二节、生物技术诊断制剂包括：1、重组表达抗原(recombinantantigen)2、核酸探针（nucleicacidprobe,geneprobe）、3、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）4、基因芯片（DNAchip）等。

特点：特异性强，可获得常规方法无法制备的一些诊断制剂，易于标准化、产业化。第22页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三一、重组表达抗原重组表达抗原：是用DNA重组技术，将编码特定抗原的基因插入原核或真核表达质粒，转入宿主细胞中使其高效表达，分离纯化产物制造成重组表达抗原。优点：高特异性、高纯度、均质性好、重复性强、成本较低，可大批量生产等；可获得常规方法无法制备的诊断抗原；也可以获得对人兽共患病特别是高危险病原体（如免疫缺陷病毒、结核分枝杆菌、炭疽杆菌等）的诊断抗原。例子：已制备出标准的乙型肝炎各组分诊断抗原。发展前景看好。第23页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三二、核酸图谱分析核酸酶切图谱寡核苷酸指纹图谱等。核酸电泳图谱第24页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（一）核酸电泳图谱分析指分离纯化的核酸，因其相对分子质量的差异而在电泳中具有不同的迁移速率并形成不同的带型。通过带型异同度的分析可确定生物体间的遗传关系（两种）

1．质粒图谱分析：质粒是耐药性、毒力因子等特殊遗传特性的载体。多数细菌往往含有大小和数量不等的质粒，具有相对稳定性，质粒图谱分析是细菌分型和流行病学调查的重要工具，具有诊断价值。

优点：该法简便、特异、快速、可靠，缺点：对一些无质粒或质粒不稳定的菌株，以及质粒相对分子质量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力。第25页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三2.RNA电泳图谱分析：分节段RNA病毒的电泳图谱分析常用。根据不同RNA片段相对分子质量具有一定差异，在PAGE电泳中的迁移速率有所不同，染色后显示出不同的电泳图谱，因而可对不同的病毒或相同病毒不同毒株的基因组加以分析比较。第26页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（二）核酸酶切图谱分析生物的cDNA，经限制性内切酶切割产生的不同片段，琼脂糖电泳后可形成不同的带型，即核酸酶切图谱，又称DNA指纹图谱。用相同的限制性内切酶消化的DNA所产生片段的异同程度，直接反映生物体间的遗传关系。用不同的限制性内切酶消化DNA可分析基因间的连锁关系。用于比较不同病原体基因组的差异，了解它们之间遗传关系。限制性酶切片段长度多态分析（RFLP）是其中一种。第27页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（三）寡核苷酸指纹图谱分析将纯化的RNA经一种特殊的RNA酶（通常为T1酶）消化后，产生许多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳分离后进行放射自显影，形成一类似指纹的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。用于RNA病毒的研究，如基因组遗传多样性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、历史演变和宿主类群关系的研究，野毒株与疫苗株的比较等。第28页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三三、核酸探针：放射性同位素、地高辛或生物素等标记核酸分子或其片段的一条链作为核酸探针，与处理样本中存在的互补链结合为双链，这个反应就称为核酸杂交或分子杂交。分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交。根据方法不同，又分为原位杂交和转印杂交。在转印杂交中，检测DNA的称为Southern杂交，检测RNA称为Northern杂交。广泛用于特定基因的检测和基因转录活性的研究。第29页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三四、聚合酶链反应（PCR)PCR技术是简便、一快速、特异、敏感的检测手段，适于检测不宜分离培养或含量极微的样品中病原体，或分析不同样品中基因片段的异同。PCR与酶切图谱分析和分子杂交技术联合应用可获得更好的效果。种类：如（RT-PCR)、荧光PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR等。第30页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三

五、基因芯片DNA芯片（DNAchip),DNA微阵列（DNAmicroarray)、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip)指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品中的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测。第31页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三20世纪90年代初，美国Fodor博士提出并研究。用于基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变与多态性分析、基因组文库作图、疾病的诊断与预测、药物筛选，以及司法与刑侦、环境与食品卫生监督等。六、其它技术核苷酸序列分析、多位点酶电泳等。

第32页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三第三节、抗体工程技术多克隆抗体

(Polyclonalantibody)一.概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗体。第33页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三二.多克隆抗体的应用免疫学检测被动免疫治疗和紧急预防三.存在问题特异性差,用于免疫学检测容易出现交叉反应

第34页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)

一、单抗概念:

通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。

二、B细胞杂交瘤的类型

小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人

1975年Kohler和Milstein建立体外淋巴细胞杂交瘤技术，1984年获得诺贝尔生理学和医学奖。第35页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三三、单抗与多抗区别如图：5.2。第36页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三四、单抗的制备（一）淋巴细胞杂交瘤技术：（lymphocytehybridomatechnology)。将经预定抗原免疫的淋巴细胞与失去次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶(TK）合成能力的骨髓瘤细胞系细胞融合，产生杂交瘤细胞，经过培养、筛选或克隆化，获得既能分泌针对预定抗原的单抗又有无限制增殖能力的杂交瘤细胞系。第37页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（二）杂交瘤技术的原理

1.亲本细胞的选择

小鼠骨髓瘤细胞:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型

免疫脾细胞:来自经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏（B细胞）第38页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三2.细胞融合骨髓瘤细胞

脾细胞融合后细胞的类型:

未融合的脾细胞杂交瘤细胞未融合的瘤细胞细胞融合杂交瘤细胞

PEG

第39页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三3杂交瘤细胞的选择性培养

DNA合成的途径：糖+氨基酸氨基喋呤

(Aminopterin,A)TK核苷酸DNA

胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)

核苷酸前体HGPRT

次黄嘌呤IMP(Hypoxanthine,H)第40页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+

，能够生长）第41页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化

筛选：免疫荧光ELISA等克隆化：有限稀释法单个细胞显微操作法软琼脂培养法第42页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三5.单克隆抗体的生产

体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水体外：无血清培养基悬浮培养等6.单克隆抗体的纯化

硫酸铵沉淀法离子交换层析

A蛋白-Sepharose亲和层析第43页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（三）操作步骤见下图：第44页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三1.B细胞的制备：纯Ag免疫小鼠2-3次，间隔2-4周，最后一次免疫结束后3-4天取其脾脏，制成108/mL的脾细胞悬液。

2．骨髓瘤细胞的制备：小鼠骨髓瘤细胞，如SP2/0或NS-1

具有营养缺陷（缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），不能在HAT培养基上生长。在10％新生犊牛血清的DMEM中培养至对数生长期，细胞数达105-106/mL，即可。第45页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三3．饲养细胞准备小鼠胸腺细胞、小鼠腹腔巨噬细胞作用：减少培养板对杂交瘤细胞的毒性，清除一部分死亡的细胞。在融合前，将饲养细胞制成所需的浓度加入培养孔中。第46页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三4.HAT选择培养基

H：次黄嘌呤(hypoxanthine),T：胸腺嘧啶核苷(thymidine)，T、H是DNA旁路合成途径的原料；

A：氨基喋吟(aminopterin)，DNA合成阻断剂。在HAT培养基，未融合的骨髓瘤细胞不能生长；未融合的脾细胞则在2周内自然死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能在培养基中生长。（见：HAT培养基筛选杂交瘤细胞示意图）第47页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三第48页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三HAT培养基筛选原理H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)

谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-杂交瘤细胞：HGPRT+，

TK+存活（不可长期存活）死亡外源性途径(旁路途径)存活第49页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三5．细胞融合1）将B细胞与骨髓瘤细胞以10:1-1:1混合，2）离心弃上清，然后缓慢加融合剂50％聚乙二醇(PEG4000),3）静置90S，渐加入HAT培养基，4）分装培养：分别加入有饲养细胞的96孔培养板孔中，置5％-10%CO2培养箱中培养。

5d后更换1/2HAT培养基，第10d改用HT培养基，第15d用完全DMEM培养基。

细胞融合的常用试剂及其配制方法参见表5.3第50页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三第51页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三6．杂交瘤细胞筛选应用ELISA、间接免疫荧光抗体试验检测各孔中的抗体，筛选阳性孔。7．杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞阳性孔，尽早克隆化。（保证单个克隆，防止染色体丢失，而丧失分泌抗体的能力）,克隆3-5次使杂交瘤细胞稳定。克隆化的方法如下：第52页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三(1)有限稀释法:

将阳性孔的细胞稀释成5-10个细胞/ml，加入96孔培养板，0.lml/孔，每孔约含一个细胞，每天用倒置显微镜观察确证是一个细胞生长。

(2)显微操作法：用有直角弯头的毛细吸管，在倒置显微镜下将分散在培养皿上的单个细胞吸入管内，移种到培养板中，即可获得单个细胞形成的克隆。第53页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三(3)软琼脂平板法：在45℃水浴中，将饲养细胞与0.5％琼脂糖（用DMEM配制）混合，倒入培养皿凝固后作为底层，后将阳性孔细胞悬于预热至45℃的培养基中与等量0.5％琼脂糖混合，再加于平皿内，置培养箱培养，经1-2周后可见小白点，即为一个克隆，自软琼脂上吸出移入培养板中培养即得单个克隆的杂交瘤细胞。

第54页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三8．杂交瘤细胞的冻存原始克隆、克隆化后的杂交瘤细胞，加DMSO，分装于小安瓶内保存于液氮中。9．单抗的生产方法

(1)动物体内生产系统：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水；

(2)细胞培养生产系统：无血清培养基悬浮培养等。10.单克隆抗体的纯化

硫酸铵沉淀法离子交换层析

A蛋白-Sepharose亲和层析第55页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（一）用作诊断试剂

1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。

2.鉴定病原体，准确诊断传染病。

3.用于肿瘤的诊断和分型

4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态

五、单克隆抗体的应用（医学上的应用）第56页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗第57页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应异种抗体反应鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应第58页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三一、概念：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。基因工程抗体

(Geneticengineeringantibody)第59页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三二、制备过程：

a、获得抗体基因片段b、将抗体基因片段导入真核细胞（如杂交瘤细胞）或原核细胞（如大肠杆菌），使之表达有免疫活性的抗体片段。主要包括：嵌合抗体、单链抗体、重构抗体、人源化抗体、Ig相关分子、噬菌体抗体、（抗体文库。）第60页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三三、几种重要的抗体（一）嵌合抗体（chimericantibody)指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体，又称杂种抗体。多为“鼠-人”类型，既抗体的Fab或F(ab)2来源于鼠类，而Fc片段来源于人类。减少了抗体中的鼠源性成分。第61页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（二）重构抗体（reshapingantibody)将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。（即在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列）第62页，讲稿共71页，2023年5月2日，星期三（三）单链抗体（single-chainantibody)

即FV分子或单链抗体蛋白：由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。（此外肽连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。）相对分子质量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性杀伤；能