土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题(kètí)2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数专题2微生物的培养(péiyǎng)与应用第一页，共三十八页。编辑课件一、课题(kètí)背景1、尿素(niàosù)的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能(cáinéng)被植物利用。2、细菌利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3第二页，共三十八页。编辑课件3、常见(chánɡjiàn)的分解尿素的微生物(异养需氧型)芽孢杆菌(gǎnjūn)、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。硝化细菌、固氮菌、根瘤菌：硝化细菌固氮菌根瘤菌代谢方式自养需氧型异养需氧型异养需氧型能量来源NH3有机物豆科植物的有机物转换过程将NH3转变成NO2-、NO3-固氮酶催化机理总反应式为：

N2+8

e-+8

H++16

Mg·ATP+16

H2O→2

NH3+H2+16Mg·ADP

+

16

Pi在固氮酶的作用下，根瘤中的菌体将分子态氮转化为氨态氮（同左）第三页，共三十八页。编辑课件4、课题(kètí)目的①从土壤中分离出能够分解尿素(niàosù)的细菌②统计(tǒngjì)每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照第四页，共三十八页。编辑课件1、实例(shílì)：启示：寻找目的菌种时要根据(gēnjù)它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为(yīnwèi)热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。第五页，共三十八页。编辑课件2、实验室中微生物的筛选(shāixuǎn)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时(tóngshí)抑制或阻止其他微生物生长。第六页，共三十八页。编辑课件15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌(xìjūn)的分离与计数所需培养基：①从物理性质(wùlǐxìngzhì)看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体(gùtǐ)培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素选择培养基唯一氮源第七页，共三十八页。编辑课件〖思考2〗该培养基对微生物

（具有(jùyǒu)，不具有(jùyǒu)）选择作用。如果具有(jùyǒu)，其选择机制是

。具有(jùyǒu)只有能够(nénggòu)以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长第八页，共三十八页。编辑课件培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能(cáinéng)分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、培养基选择(xuǎnzé)分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定(tèdìng)种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。第九页，共三十八页。编辑课件※几种(jǐzhǒnɡ)常见选择培养基1、加入(jiārù)青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌(méjūn)等真菌2、不加氮源的无氮培养基分离固氮菌3、不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物4、加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌第十页，共三十八页。编辑课件1.间接计数法（活菌计数法）（1）常用(chánɡyònɡ)方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释(xīshì)度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

当样品的稀释(xīshì)度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法。㈡.统计菌落数目：第十一页，共三十八页。编辑课件注意事项:①为了保证(bǎozhèng)结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布至少3个平板，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。第十二页，共三十八页。编辑课件如何(rúhé)从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式(gōngshì)进行计算教材(jiàocái)P22第十三页，共三十八页。编辑课件2、显微镜直接(zhíjiē)计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定(yīdìng)容积里样品中微生物的数量。㈡.统计(tǒngjì)菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点第十四页，共三十八页。编辑课件实例(shílì)分析P22

你认为哪个(nǎge)同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？第十五页，共三十八页。编辑课件实例(shílì)分析P22

第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果(jiēguǒ)不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。第十六页，共三十八页。编辑课件

设置对照的主要目的(mùdì)是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）.设置(shèzhì)对照：

实例(shílì)：教材P23

原因：

⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)第十七页，共三十八页。编辑课件小结：通过这个事例可以(kěyǐ)看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同(xiānɡtónɡ)土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明(zhèngmíng)培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第十八页，共三十八页。编辑课件菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养根据图示2－7填写以下实验(shíyàn)流程：实验设计：第十九页，共三十八页。编辑课件

实验的具体操作

㈠.土壤取样（微生物的天然培养基）

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样（3-8cm），将样品装入事先准备(zhǔnbèi)好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第二十页，共三十八页。编辑课件

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌(mièjūn)的试管和1个灭菌的移液管。第二十一页，共三十八页。编辑课件◆应在火焰旁称取土壤(tǔrǎng)10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的(mùdì)：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板[三]样品(yàngpǐn)的稀释第二十二页，共三十八页。编辑课件

为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量(shùliàng)，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层(shàngcéng)样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。第二十三页，共三十八页。编辑课件㈣.取样(qǔyàng)涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型(lèixíng)、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上(yǐshàng)菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。第二十四页，共三十八页。编辑课件㈤.微生物的培养(péiyǎng)与观察

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目(shùmù)。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

培养(péiyǎng)不同微生物往往需要不同培养(péiyǎng)温度。细菌：30～37℃培养1～2d

放线菌：25～28℃培养5～7d

霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第二十五页，共三十八页。编辑课件

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数(jìshù)。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

第二十六页，共三十八页。编辑课件微生物的培养(péiyǎng)与观察第二十七页，共三十八页。编辑课件（六）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化(cuīhuà)尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性第二十八页，共三十八页。编辑课件三、操作(cāozuò)提示无菌操作(cāozuò)

做好标记(biāojì)

制定计划

第二十九页，共三十八页。编辑课件课题成果(chéngguǒ)与评价

（一）培养(péiyǎng)物中是否有杂菌污染以及选择培养(péiyǎng)基是否筛选出菌落

对照的培养(péiyǎng)皿在培养(péiyǎng)过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。第三十页，共三十八页。编辑课件如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要(xūyào)进一步分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作(cāozuò)是否成功

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功(chénggōng)，并能够进行菌落的计数。

（三）重复组的结果是否一致第三十一页，共三十八页。编辑课件1.水中大肠杆菌数目的检测（P26）

伊红美蓝培养基2.空气中微生物总数的检测3.牛奶中细菌的分离(fēnlí)与计数4.土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数相关(xiāngguān)连接：第三十二页，共三十八页。编辑课件相关(xiāngguān)连接：空气中微生物总数(zǒngshù)的检测第三十三页，共三十八页。编辑课件本课题(kètí)知识小结:第三十四页，共三十八页。编辑课件1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）

A.在液体培养基上进行B.至少接种一种细菌

C.接种一个细菌D.及时补充消耗的营养物质2.使用选择培养基的目的是（）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他(qítā)微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素实践(shíjiàn)训练A

CD第三十五页，共三十八页。编辑课件4.下列说法不正确的是（）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比(xiānɡbǐ)，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）

A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质

C.青霉素类药物D.高浓度食盐BC第三十六页，共三十八页。编辑课件（09，宁夏，15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑(kǎolǜ)营养条件外，还要考虑(kǎolǜ)______、______和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止