攻读硕士学位开题报告培训课件

研究生：杨波指导老师：傅少志博士导师：吴敬波教授专业：肿瘤学2014年11月研究课题：叶酸受体靶向的TPT纳米药物联合时辰放疗对鼻咽癌的协同作用及相关机制研究目录一、研究背景及现状二、研究目的三、研究方法四、拟解决关键问题六、参考文献五、计划进度1、癌症高发2、鼻咽癌在我国南方及东南亚国家多发一、研究背景、基础及现状《一》研究背景1、生物节律紊乱：作为一种基本的生命现象，生物节律的紊乱与肿瘤的发生发展有着密切关系[1]《二》研究基础[1]SawidisC,KoutsilierisM.Circadianrhythmdisruptionincancerbiology.Mol.Med.2012:1249-602、细胞周期：移植于裸鼠的人鼻咽癌细胞(CNE-Ⅱ)中DNA合成具生物节律,G1、S、G2、M期细胞分别随时间变化也有显著差异[2,3][2]XianLJ,SunJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisinnasopharyngealcarcinomacell.Chronobiol.Int.2002,19(1):69.[3]SunJ,XianLJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisandapoptosiscorrelatedgeneexpressioninbonemarrowcellsofnudebearinghumannasopharyngealcarcinoma.AiZheng,2002,21(8):833放射敏感性与细胞增殖周期具有时相关系：细胞在接近和处于M期时最敏感，S后期对放射最抗拒多种肿瘤细胞进入S期的比例与正常细胞通常有8-12小时的间隔优化调整对肿瘤细胞进行放疗的时间[4,5]为肿瘤放疗选择更合适的时间避开正常细胞的合成高峰最大限度杀灭肿瘤细胞[4]UlmerW,CornelissenG,RevillaM,etal.Circadianandcircaseptandependenceofthebeta-ATPpeakoffourdifferentcancercellcultures:implicationsforchronoradiotherapyScriptaMdeica,2001,74(2):87.[5]BjarnasonGA,MackenzieRG,NabidA,etal.Comparisonoftoxicityassociatedwithearlymorningversuslateafternoonradiotherapyinpatientswithhead-and-neckcancer:AprospectiverandomizedtrialofthenationalcancerinstituteofCanadaClinicalTrialsGroup(HN3).Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2009;73:166-72.时辰治疗人体正常组织肿瘤组织药代谢动力学肿瘤时辰治疗学[6]生物钟理论3、肿瘤时辰治疗学[6]InnominatoPF,LeviFA,BjarnasonGA.Chronotherapyandthemolecularclock:clinicalimplicationsinoncology.Adv.DrugDeliveryRev.2010;62:979-1001时辰治疗:旨在制定优化的时间调节方案,选择毒性最小、疗效最好的时间给予治疗不同时辰放疗节律标志细胞增殖周期体温肿瘤细胞代谢指标对鼻咽癌的时辰化疗研究也发现，时辰给药较常规给药疗效更佳，副反应也显著减轻[7,8][7]ZarogoulidisP,DarwicheK,HuangH,etal.Timerecall;Futureconceptofchronomodulatingchemotherapyforcancer.Curr.Pharma.Biotechnol.2013;14:632-42.[8]LinHX,HuaYJ,ChenQY,etal.Randomizedstudyofsinusoidalchronomodulatedversusflatintermittentinductionchemotherapywithcisplatinand5-fluotouracilfollowedbytraditionradiotherapyforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma.Chin.J.Cancer.2013;32(9):502-11《三》研究现状前期实验证明TPT对人鼻咽癌裸鼠移植瘤有放射增敏作用[9-11]其重要原因可能为：①细胞周期变化②促进凋亡③拓扑异构酶-I的表达水平改变拓扑替康的时辰放射曾敏作用机制：①肿瘤的乏氧程度②细胞周期③DNA损伤④拓扑异构酶-I的表达水平[12][12]ZhangY,ChenX,RenP,etal.Synergisticeffectofcombinationtopotecanandchronomodulatedradiationtherapyonxenograftedhumannasopharyngealcarcinoma.InRadiat.Oncol.Biol.Phys.2013,87(2):356-62无关图片TPT传统剂型缺乏靶向性鼻咽癌解剖位置的特殊性纳米医学控制药物释放速率延长药物在血液中的半衰期具有靶向性[13][13]LiuJ,HuangY,KumarA,etal.pH-Sensitivenano-systemsfordrugdeliveryincancertherapy.Biotechnol.Adv.2013,Inpress.[14]Hernandez-PedroNY,Rangel-LopezE,Magana-MaldonadoR,etal.ApplicationofNanoparticlesonDiagnosisandTherapyinGliomas.BioMed.Res.Inter.2013,Hindawi.当前的纳米药物主要依靠自身的被动靶向功能（EPR效应）在肿瘤组织富集，并不具备对肿瘤细胞产生特异性识别的主动靶向功能[14-16]不理想！无关图片《四》研究新进展鼻咽癌细胞表面有丰富的叶酸受体表达[17]新思路：构建叶酸受体靶向的纳米药物传输体系[17]XieM,ZhangH,XuY,etal.Expressionoffolatereceptorsinnasopharyngealandlaryngealcarcinomaandfolatereceptor-mediatedendocytosisbymoleculartargetednanomedicine.Int.J.Nanomed.2013;8:2443-51.载药粒子示意图MPEGTPTFAPCL载药粒子载有药物的纳米粒子进入肿瘤细胞载体降解，药物释放杀死肿瘤细胞[18][18]WeiX,PhilipSL.Folate-targetedtherapiesforcancer.J.Med.Chem.2010;53:6811-24.作用过程示意图二、研究目的（1）研究鼻咽癌细胞对拓扑替康纳米药物的特异性摄取，验证其主动靶向功能。（3）构建具有主动靶向功能和放射增敏功能的纳米药物制剂（2）阐明增敏机制研以致用知其所以然技术路线图合成MPEG-PCL聚合物合成MPEG-FA-PCL聚合物制备MPF/TPT纳米粒子建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型、分组并进行时辰放疗三、研究方法单纯放疗组主动靶向纳米药物+放疗组非主动靶向纳米药物+放疗组单纯主动靶向纳米药物组非纳米药物组生理盐水组肿瘤大小及动物体征观察处死动物、剥离瘤块、组织固定和冻存免疫组化检测肿瘤细胞放射敏感性流式细胞技术检测细胞周期免疫组化检测肿瘤组织微血管密度免疫组化检测叶酸受体表达免疫组化检测肿瘤乏氧情况免疫组化检测TOPI表达TUNEL检测细胞凋亡数据整理和统计分析阐明主动靶向功能的拓扑替康纳米粒子对时辰放疗曾敏的分子机制聚甲氧基乙二醇（MPEG）己内酯（CL）MPEG-PCL叶酸（FA）《一》体外实验——1、纳米药物的制备MPEG-PCL-FATPTMPA/TPTMPF/TPT2、MPF/TPT理化性质及相关生物学性质研究透射电镜（TEM）形貌动态光散射法粒径及分布高效液相色谱（HPLC）载药量和包封率PBS透析袋法药物释放行为溶血实验血液相容性MTT细胞毒性3、验证主动靶向性主动靶向纳米药物非主动靶向纳米药物非纳米药物生理盐水组人鼻咽癌低分化鳞癌细胞株（CNE-II）免疫组化检测摄取量《二》体内实验人鼻咽癌低分化鳞癌细胞株（CNE-II）细胞培养接种裸鼠裸鼠生物节律建立《三》实验分组3HALO9HALO15HALO21HALOMPF/TPT+RT10101010MP/TPT+RT10101010MPF/TPT10101010TPT10101010RT10101010NS10101010分组时辰《四》放射计量效应曲线不同时辰采用不同放射计量对比最佳放射治疗时辰点以及最佳剂量Envision二步免疫组化法肿瘤细胞放射敏感性拓扑异构酶I的表达裸鼠肿瘤组织乏氧程度TUNEL检测肿瘤细胞凋亡肿瘤细胞周期分析LSAB法检测肿瘤组织微血管《五》机制探讨四、拟解决的关键问题（1）制备TPT纳米药物传输体系。（2）研究纳米药物运载体是否具有主动靶向功能？（3）纳米药物与时辰放疗联合是否具有协同作用并研究其机制？五、计划进度起止年限计划进度和预期目标2014.11~2015.62015.6~2016.22016.2~2016.102016.10~2017.6构建主动靶向的纳米药物并进行体外理化性质研究纳米药物的体内外抗肿瘤效果及主动靶向功能验证体内实验，考察纳米药物的抗肿瘤效果机制研究[1]SawidisC,KoutsilierisM.Circadianrhythmdisruptionincancerbiology.Mol.Med.2012:1249-60[2]XianLJ,SunJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisinnasopharyngealcarcinomacell.Chronobiol.Int.2002,19(1):69.[3]SunJ,XianLJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisandapoptosiscorrelatedgeneexpressioninbonemarrowcellsofnudebearinghumannasopharyngealcarcinoma.AiZheng,2002,21(8):833[4]UlmerW,CornelissenG,RevillaM,etal.Circadianandcircaseptandependenceofthebeta-ATPpeakoffourdifferentcancercellcultures:implicationsforchronoradiotherapyScriptaMdeica,2001,74(2):87.六、参考文献[5]BjarnasonGA,MackenzieRG,NabidA,etal.Comparisonoftoxicityassociatedwithearlymorningversuslateafternoonradiotherapyinpatientswithhead-and-neckcancer:AprospectiverandomizedtrialofthenationalcancerinstituteofCanadaClinicalTrialsGroup(HN3).Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2009;73:166-72.[6]InnominatoPF,LeviFA,BjarnasonGA.Chronotherapyandthemolecularclock:clinicalimplicationsinoncology.Adv.DrugDeliveryRev.2010;62:979-1001[7]ZarogoulidisP,DarwicheK,HuangH,etal.Timerecall;Futureconceptofchronomodulatingchemotherapyforcancer.Curr.Pharma.Biotechnol.2013;14:632-42.[8]LinHX,HuaYJ,ChenQY,etal.Randomizedstudyofsinusoidalchronomodulatedversusflatintermittentinductionchemotherapywithcisplatinand5-fluotouracilfollowedbytraditionradiotherapyforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma.Chin.J.Cancer.2013;32(9):502-11.[9]吴敬波、文庆莲、范娟等.拓扑替康对鼻咽癌放射曾敏的体内实验[J].中国耳鼻咽喉头颈外科，2007,14（2）：82-85[10]文庆莲、吴敬波.拓扑替康对鼻咽癌放射曾敏机制的研究[J].中国癌症杂志，2005,15（1）：49-51[11]文庆莲、吴敬波、何芬等.拓扑替康对裸小鼠鼻咽癌放射曾敏作用的分子水平探讨[J].中国肿瘤临床，2006,23（13）：1000-8179[12]ZhangY,ChenX,RenP,etal.Synergisticeffectofcombinationtopotecanandchronomodulatedradiationtherapyonxenograftedhumannasopharyngealcarcinoma.InRadiat.Oncol.Biol.Phys.2013,87(2):356-62[13]LiuJ,HuangY,KumarA,etal.pH-Sensitivenano-systemsfordrugdeliveryincancertherapy.Biotechnol.Adv