ATP结合盒转运体A1基因R219K多态与冠心病的相关性研究

ATP结合盒转运体A1基因R219K多态与冠心病的相关性研究

作者：王玉明李亚郑人源潘克俭

【摘要】目的探讨ATP-BindingCassetteTransporter1基因R219K多态在中国汉族人群中的分布及其与冠心病的关系。方法采用PCR-RFLP方法，对396例CHD患者和417名正常人ABCA1基因R219K多态位点进行分析。结果对照组R219K多态K等位基因及KK基因型的频率较CHD组显着为高；根据发病年龄分组，早发CHD组K等位基因及KK基因型频率明显低于晚发CHD组和对照组，而在对照组和晚发CHD组间此频率差异无显着性；KK基因型患者血浆甘油三酯水平较RR基因型显着降低；不同基因型患者血浆高密度脂蛋白胆固醇水平差异无显着性。结论ABCA1基因R219K多态与CHD存在相关性；KK基因型可能具有对抗动脉粥样硬化的作用，但这种作用不伴有血浆HDL-C水平的改变。

【关键词】冠心病；ABCA1基因；动脉粥样硬化

Abstract：ObjectiveToinvestigatethedistributionofR219KpolymorphisminATP-BindingCassetteTransporter1geneinChineseHanpopulationandtheassociationofthispolymorphismwithcoronaryheartdisease.MethodsGenotypesweredeterminedbyPCR-RFLPmethodin417unrelatedhealthycontrolsand396CHDThefrequenciesofKalleleandKKgenotypeforcontrolsweresignificantlyhigherthanthoseforpatients.Whenthepatientsweredividedintotwosubgroupsbyonset-age,thefrequenciesofKalleleandKKgenotypeforearly-onsetpatientsweresignificantlylowerthanthose(、)forlate-onsetpatientsandthoseforcontrols,whiletherewerenosuchdifferencesbetweenlate-onsetpatientsandwithRRgenotypehadasignificantlyhigherplasmaconcentrationoftriglycerideswhencomparedwiththatofKKgenotype.Nosignificantdifferencesofplasmahigh-densitylipoproteincholesterollevelwereobservedamongpatientswithdifferentThesedatasuggestthattheR219KpolymorphisminABCA1geneiscorrelatedwithCHD，andtheABCA1geneKKgenotypemayhasafunctionagainstatherosclerosiswithoutdetectablechangeofplasmaHDL-ClevelinChineseHanpopulation.Keywords:coronaryheartdisease；ATP-BindingCassetteTransporter1gene；atherosclerosis

研究表明，血浆中高密度脂蛋白水平与动脉粥样硬化的发生呈负相关［1］，HDL对抗AS的功能可能与其在胆固醇逆向转运中的作用有关［2］。近年来的研究发现，ABCA1基因在胆固醇逆向转运和HDL生成的起始阶段发挥关键的作用［3、4］。人类ABCA1基因定位于9q22～9q31，编码一种跨膜转运蛋白，该蛋白参与调控脂质的细胞流出过程,并通过与载脂蛋白A-1作用促进新生HDL的形成［5］。文献报道，ABCA1基因突变可导致细胞内脂质流出减少，血浆中HDL-C严重缺乏，从而使早发CHD的风险显着增高［3、4］。此外，某些单核苷酸多态可通过改变ABCA1基因表达产物的活性或剂量，影响血脂水平或不同基因型个体对CHD的易感性［6］。作者使用PCR-RFLP方法对中国汉族健康人群和CHD患者ABCA1基因R219K多态位点进行了分析，并探讨了该多态与CHD及血脂水平的关系。

1对象和方法

对象

正常对照组无血缘关系的四川汉族健康个体417名，其中男248名、女169名，平均年龄(±)岁，经询问病史、体检、心电图等检查排除心血管疾病史。

冠心病患者组四川大学华西医院心血管科住院部冠心病患者396例，其中，男237例、女159例，平均年龄(±)岁。所有病例均经冠状动脉造影证实为CHD，其冠状动脉至少有一支狭窄度≥50%。

方法

血脂水平的检测

研究对象均采用禁食12h后取外周血5ml测定血脂水平。TG和TC采用氧化酶法测定，HDL-C、LDL-C以及VLDL-C用PEG变构酶法测定。

研究个体DNA的制备

采集病例与对照外周血5ml，1mlACD抗凝剂抗凝。盐析法抽提DNA后TEbuffer溶解并置于4℃冰箱中备用。

ABCA1基因多态片段的PCR扩增

根据基因组序列，设计PCR引物，引物序列：正向：5′-AAGTGTCCTGTCATTGTGCC-3′、反向：5′-TCTCCAGTGAGCAAGTCTAC-3′。PCR反应在PTC-200型循环仪中进行，扩增片段长度为404bp。PCR反应体系：反应总体积30μl，包括μg基因组DNA，Taq聚合酶1U，MgCl2浓度/L，10×buffer3μl，dNTP各200μmol/L。扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

PCR产物的酶切消化

取10μlPCR扩增产物，加入5U限制性内切酶XagI，2μL10×酶切buffer,并加超纯水至总体积20μl，37℃水浴中保温16h。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RADGelDoc凝胶分析系统判定基因型。

统计学处理

计算各组基因型及等位基因频率，经χ2检验，确认符合Hardy-Weinberg平衡；组间各等位基因频率和基因型频率比较采用χ2检验；组间不同基因型血脂水平比较用单因素方差分析。数据用SPSS12软件进行分析，以P＜为差异有显着性。

2结果

CHD组和对照组临床特点比较

两组间年龄、性别构成比以及血浆中TC、VLDL-C水平差异无显着性；与对照组比较，CHD组TG、LDL-C水平在升高的同时，HDL-C水平显着降低。

基因型鉴定

R219K多态为ABCA1基因第219位密码子G→A碱基转换，其中，A等位基因存在限制性内切酶XagI的切点，从而导致3种基因型的出现：RR型图1R219K多态位点的RFLP-PCR电泳结果

1：KK纯合子；2、3：RR纯合子；4、5、6：RK杂合子；M：DNA分子量标准(puc19/MspI)

ElectrophoresisresultofPCR-RFLPanalysisofR219Kpolymorphism

Lane1:KKhomozygote:lane2、3：RRhomozygote;Lane4、5、6:RKheterozygote;M:DNAmarker(puc19/MspI)，酶切后长度仍为404bp；KK型，酶切产物为310bp和94bp两个片段；RK型(GA型、3种片段的杂合子)，酶消化后显示大小分别为404bp、310bp、94bp的3个片段。

CHD组与对照组间基因型和等位基因频率的比较R219K多态各基因型在两组中分布符合遗传Hardy-Weinberg平衡。经χ2检验，等位基因R、K频率在两组间分布差异有显着性，对照组K等位基因频率显着高于CHD组；对照组KK基因型频率显着高于CHD组；CHD与K等位基因负关联［OR=，95%CI(,)］；与基因型KK负关联［OR=，95%CI］。

CHD分组后基因型和基因频率分布比较表1ABCA1基因R219K的基因型及等位基因频率在对照组和CHD组中的分布照组比较，P＜）；OR：oddsratio。

参照有关CHD发病年龄分类标准［7］，将CHD组分为早发CHD组和晚发CHD组，并对两个亚组基因及基因型频率分布进行分析。早发CHD组K等位基因及KK基因型频率在明显低于对照组的同时。表2R219K基因型和等位基因在早发CHD组和晚发CHD组中的频率分布CHD组比较，△P＜）。

不同基因型患者间血脂水平的比较

方差分析结果表明，RR基因型的患者血浆TG水平在明显高于KK基因型患者的同时，也有高于RK基因型患者的倾向。表3不同基因型患者血脂水平比较*P＜;血脂指标浓度单位均为mmol/L(unitsofplasmalipidlevelsaredenotedbymmol/L)

3讨论

R219K多态为ABCA1基因第219密码子G→A转换，导致Arg→Lys氨基酸替代。我们首次报道K等位基因频率在中国汉族群体为，较德国人频率、芬兰人［6］显着增高。另外，Yamakawa［6］等在327名中学生群体筛查的结论支持K等位基因在日本人群中可能为野生型，高于上述报道的频率。说明R219K多态的变异频率在不同的种族间存在差异性。

Clee［8］等在对荷兰CHD患者的研究中发现，K等位基因能减少冠状动脉再狭窄、心肌梗塞、死亡等并发症的发生率，并能减缓AS的进程，提出K等位基因对于减少冠心病的发生具有保护作用。我们采用病例—对照研究，分析了中国汉族健康人群和CHD患者R219K多态性。结果显示，对照组K等位基因及KK基因型频率均显着高于CHD组。表明该多态可能与中国人CHD存在相关性，并提示纯合状态下的K等位基因可能是拮抗AS的保护因子，与Clee等报道略有不同。

在此基础上，作者根据CHD患者发病年龄进行分组，结果可见早发CHD组K等位基因和KK基因型频率均较晚发CHD组降低，而上述基因和基因型频率在对照组和晚发CHD组间差异无显着性，提示KK基因型和CHD发病年龄相关，对于CHD的发生，KK基因型年轻个体较RR、RK基因型年轻个体可能具有更低的易感性，更易于晚发CHD。因而也从另一角度提示KK基因型可能对减少冠心病的发生具有保护作用。

值得注意的是，未见不同基因型患者间血浆HDL-C水平有显着差异。Zwarts［9］等在对该基因其它多态研究中也得出类似结论，并认为K等位基因对抗AS的作用并非表现为血浆HDL-C浓度升高。转基因动物模型研究［10］发现，ABCA1基因的过度表达，导致小鼠巨噬细胞内胆固醇流出的增加，但血浆中HDL-C浓度变化甚微。提示，RCT速度的加快，可能

［1］WilsonPWF，AbbottRD,CastelliWDensityLipoproteinCholesterolandMortality．TheFraminghamHeartStudy［J］．Arteriosclerosis，1988，8：737-741.

［2］GlomsetJA，NorumKR．TheMetabolicRoleofLecithin：CholesterolAcyltransferase：PerspectivesFromPathology［J］．AdvlipidRes，1973,11：1－65.

［3］Brooks-WilsonA.，MarcilM，CleeSM，etal．MutationsinABC1inTangierDiseaseandFamilialHigh-densityLipoproteinDeficiency［J］．NatGenet，1999，22：336－345.

［4］RustS，RosierM，FunkeH，etal．TangierDiseaseisCausedbyMutationsintheGenencodingATP-BindingCassetteTransporter1［J］．NatGenet，1999，22：352－355.

［5］AttieAD，KasteleinJP，haydenMR．PivotalRoleofABCA1inReverseCholesterolTransportInfluencingHDLLevelsandSusceptibilitytoAtherosclerosis［J］．JLipidRes，2001，42：1717－1726.

［6］RoshniRSingaraja，LiamR,BrunhamHenkVisscher，etal．EffluxandAtherosclerosistheClinicalandBiochemicalImpactofVariationsintheABCA1Gene［J］．ArteriosclerThrombVascBiol，2003，23：1322－1332.

［7］王晓玲，顾东风.冠心病遗传因素的研究进展［J］．中华医学遗传杂志，2000，17：452－454.

［8］CleeSM，ZwindermanAH，EngertJC，etal．CommonGeneticVariationinABCA1isAssociatedwithAlteredLipoproteinLevelandaModifiedRiskforCoronaryArteryDisease［J］．Circulation，2001，103：1198－1205.

［9］ZwartsKY，CleeSM