叶绿体色素含量的测定

关于叶绿体色素含量的测定第1页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验目的

叶片的叶绿素含量直接影响着光合速率，并与氮素营养有密切的关系，在栽培、生理、农化、育种等研究上是重要的诊断指标，常需测定和控制叶绿素含量。

掌握使用分光光度计定量测定叶绿素含量第2页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三叶绿素含量测定方法叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯-比尔定律计算出提取液中各色素的含量第3页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验原理

1

根据朗伯-比尔定律当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

即：A=K*L*CK：比吸收系数L：液层厚度C：溶质浓度(克/L)

第4页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三比吸收系数()的物理意义Lambert-Beer定律中的比例系数“K”的物理意义是：吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度第5页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三比吸收系数()的性质①

κ与溶液的浓度和液层厚度无关，与吸光物质的特性及光的波长等有关，也受温度和溶剂的影响。②对于同一波长下，当其他条件一定时(温度、溶剂等)，κ的大小取决于物质的性质。③

对于同一物质，当其他条件一定时(温度、溶剂等)，κ的大小取决于波长。

∴κ能表示物质对某一波长的光的吸收能力。κ越大，表明物质对某波长的光吸收能力越强。第6页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验原理

2吸光度的加和性

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和

即：A=A1+A2+……+An第7页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三叶绿体色素提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素;只需测定该溶液在三个特定波长下的吸光度;根据这三个色素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度第8页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三红光区蓝紫光区645nm663nm叶绿素a:663nm处最大吸收峰；叶绿素b:645nm处最大吸收峰；且两吸收曲线相交于652nm处第9页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三类胡萝卜素→吸收兰紫光，不吸收红光等长

波长的光叶绿素→吸收红光、兰紫光在测定叶绿素a、叶绿素b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。第10页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三叶绿素a和叶绿素b的80%丙酮溶液，当浓度在1g/L时，比吸收系数k值:波长（nm）K值叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60645nm663nm第11页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三据此可列出下列方程式：A663、A645分别为叶绿素溶液在波长663、645nm处的光密度;Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(单位:克/升)A663=A叶绿素a+A叶绿素bA663=KaLCa+KbLCbA663=82.04Ca+9.27Cb……………(1)A645=16.75Ca+45.6Cb……………(2)第12页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三将上式整理，可以得到下式：Ca(g/L)=

0.0127A663-0.00269A645（3）Cb(g/L)=

0.0229A645-0.00468A663（4）将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为：Ca(mg/L)=

12.7A663-2.69A645（5）Cb(mg/L)=

22.9A645-4.68A663（6）－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）CT为叶绿素的总浓度第13页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三红光区蓝紫光区645nm663nm470nm第14页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三类胡萝卜素含量的测定在叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定溶液中的类胡萝卜素含量在80％丙酮提取液中三种色素含量的计算公式(单位：mg/L)：C类胡萝卜素=(1000A470–3.27Ca–104Cb)/229第15页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三

由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，使用其他溶剂提取色素时，计算公式有所不同第16页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验材料与器材

实验材料：青菜

实验器材：50ml容量瓶、小漏斗，5ml移液管一只，研钵一套，剪刀一把，滤纸，天平，722型分光光度计

实验试剂：80%丙酮第17页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验步骤

11.鲜叶洗净，吸水纸吸干，称取0.5克（避开主叶脉）剪碎置于研钵中加少量石英砂和80%丙酮（约2-3ml）研成匀浆；2.倒入约20ml80%丙酮，静置10分钟；3.将上清液沿玻棒移入过滤的漏斗中（滤纸用80%的丙酮湿润），滤入50ml容量瓶中；4.残渣留在研钵里，再用80%丙酮反复提取2-3次，直至残渣变白无绿色；5.然后用丙酮液冲洗滤纸变白为止；6.再用丙酮液定容到刻度，即为叶绿素提取液。第18页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验步骤

2

将上述提取液注入1cm光径的比色皿中（以80%丙酮液为对照）

用分光光度计分别在645nm、663nm、470nm处读取光密度。第19页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三Ca=

12.7A663-2.69A645

Cb=

22.9A645-4.68A663

(单位：mg/L)C类胡萝卜素=(1000A470–3.27Ca–104Cb)/229第20页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验步骤

3将读取的光密度A645和A663，计算提取液叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度或叶绿素的总浓度，然后按下式计算叶绿素类胡萝卜素在叶片中的含量：叶绿素含量或类胡萝卜素(鲜重%)=或：叶绿素含量或类胡萝卜素(毫克/克鲜重)=第21页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验步骤叶片洗净、吸干、去大叶脉↓称0.5g叶,用80%丙酮研磨↓匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）↓滤液用80%丙酮定容到50ml↓测A645、A663、A470

计算浓度和含量第22页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三实验结果第23页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三注意事项1.为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间尽量短些2.注意叶绿素一定要提取干净，避免造成测定误差3.叶绿素提取液不能混浊4.分光光度计转换波长时要重新调零5.实验过程中使用同一台分光光度计测量第24页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三思考题1、分光光度法与一般的比色法有何异同？2、叶绿素a和b在蓝光区也均有最大吸收峰，能否用这最大吸收峰波长进行叶绿素的定量测定分析？为什么？

第25页，讲稿共31页，2023年5月2日，星期三分光光度计使用方法1.开启电源，指示灯亮，仪器预热20分钟。2.波长调至测试用波长。3.开盖T调0。（调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”）4.放入空白对照液，将光路对准空白对照位置5.关盖T调100。（调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”）6.调A为0。（调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”）